基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的青黛治療潰瘍性結(jié)腸炎作用機(jī)制研究△

王依，史瑞，李軍祥*，劉豫玥，袁亞利，萬雯

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 東方醫(yī)院，北京 100078

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是以結(jié)腸和直腸黏膜連續(xù)性、彌漫性炎癥改變?yōu)樘攸c(diǎn)的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，以腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重為主要臨床表現(xiàn)[1]。在我國UC 發(fā)病高峰年齡為20～49歲，性別差異不明顯[2]。近20年來我國UC的發(fā)病率呈現(xiàn)快速上升趨勢[3]，因此UC 治療策略的制定受到越來越多的關(guān)注。目前，UC的常規(guī)治療多以氨基水楊酸類制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑為主[4]，但這些藥物存在療效不穩(wěn)定、停藥后易復(fù)發(fā)、價(jià)格昂貴等問題。中醫(yī)藥在改善UC 患者臨床癥狀、緩解疾病、防止疾病復(fù)發(fā)、減少不良反應(yīng)等方面具有優(yōu)勢[5-7]。因此，可預(yù)防和治療UC 的中藥具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

青黛具有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚之效?，F(xiàn)代藥理研究表明，青黛具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫力、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等作用，可下調(diào)白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子水平，故能有效預(yù)防和治療UC[8]。青黛及其復(fù)方治療UC 具有較好的臨床療效，且能有效修復(fù)腸道黏膜[9-12]。青黛與化學(xué)藥聯(lián)用治療UC 時療效優(yōu)于化學(xué)藥單用，且臨床不良反應(yīng)小[13]。盡管青黛治療UC的臨床研究較多，但其作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)尚未完全明確。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘青黛治療UC 的靶點(diǎn)和通路，以期為青黛的進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 青黛活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/）檢索青黛所有化學(xué)成分，并設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為閾值，對所有檢測到的化學(xué)成分進(jìn)行篩選，得到青黛潛在的有效成分，并找出每個成分對應(yīng)的靶點(diǎn)。將成分對應(yīng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），檢索各靶點(diǎn)對應(yīng)的人類基因簡稱。

1.2 疾病靶點(diǎn)及藥物作用于疾病有效靶點(diǎn)預(yù)測

通過GeneCard 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/），以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞查找得到與UC 相關(guān)的靶點(diǎn)。利用R軟件將查找到的青黛作用靶點(diǎn)與UC疾病靶點(diǎn)取交集，得到青黛治療UC 的預(yù)測靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.0 軟件將青黛、成分、靶點(diǎn)及疾病之間的相互關(guān)系構(gòu)建成相互作用網(wǎng)絡(luò)。并以接近中心度（closeness）、度（degree）、介度中心度（betweenness）為主要分析指標(biāo)，收集每個點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)值，將相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，得到核心化學(xué)成分及核心基因。

1.4 生物通路分析

運(yùn)用基因注釋工具M(jìn)etascape（https://metascape.org/）及R軟件對上述核心靶點(diǎn)進(jìn)行生物功能及通路富集分析，預(yù)測青黛參與治療UC 的主要生物功能及生物通路，分析相關(guān)作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 青黛活性成分及靶點(diǎn)篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫，共搜索到青黛化學(xué)成分29 個，設(shè)置閾值（OB≥30%和DL≥0.18）后，得到符合要求的化學(xué)成分9 個（表1），對應(yīng)96 個靶點(diǎn)，排除重復(fù)值后得到68個靶點(diǎn)。將靶點(diǎn)輸入到UniProt網(wǎng)站檢索與人類有關(guān)的靶點(diǎn)蛋白簡稱，將無法檢測到與人類相關(guān)的靶點(diǎn)排除，最終獲得29個靶點(diǎn)。

表1 青黛有效成分

2.2 UC疾病靶點(diǎn)及青黛作用于UC的有效靶點(diǎn)

通過GeneCard、OMIM 網(wǎng)站共獲得與UC 相關(guān)的靶點(diǎn)4356 個。將上述青黛的29 個潛在靶點(diǎn)通過R軟件與UC 靶點(diǎn)取交集，最終得到青黛作用于UC 有效靶點(diǎn)18 個（圖1），通過18 個靶點(diǎn)找到相對應(yīng)的化合物7 個（圖2），分別為10H-吲哚并[3，2-b]喹啉、異靛藍(lán)、靛藍(lán)、6-（3-氧代吲哚-2-亞甲基）吲哚并[2，1-b]喹唑啉-12-酮、靛玉紅、β-谷甾醇、異維他汀。

圖1 青黛與UC交集靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 青黛成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)

將青黛7 個有效成分、18 個有效靶點(diǎn)及對應(yīng)的UC 靶點(diǎn)輸入到Cytoscape 3.7.0 軟件中，繪制出各節(jié)點(diǎn)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。從相互作用網(wǎng)絡(luò)圖中各節(jié)點(diǎn)與邊的多種聯(lián)系可知，青黛治療UC具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)。在Cytoscape 3.7.0 中計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)值，使用CytoHubba App調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)參數(shù)值，以接近中心度、度、介度中心度為主要分析指標(biāo)，設(shè)定Top25 nodes為篩選條件，收集每個點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)值，將相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，得到以靛玉紅、β-谷甾醇為核心的化學(xué)成分及包括環(huán)加氧酶1（PTGS1）、雌激素受體1（ESR1）、雄激素受體（AR）、絲氨酸蛋白酶1（PRSS1）、轉(zhuǎn)錄因子p65（RELA）、半胱氨酸蛋白酶-3（CASP3）、CASP8、CASP9 在內(nèi)的核心靶點(diǎn)，結(jié)果見表2～3。

圖3 青黛治療UC的藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

表2 青黛治療UC的核心活性成分

表3 青黛治療UC的前10位核心靶點(diǎn)

2.4 生物功能及通路富集分析

將藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)中得到的前10 位核心靶點(diǎn)進(jìn)行以生物功能為主的基因本體（GO）分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。運(yùn)用基因注釋工具M(jìn)etascape進(jìn)行GO 生物功能分析時設(shè)定物種為“H Sapiens”、P≤0.01，富集結(jié)果顯示前20條（圖4），顏色越深表示生物作用越強(qiáng)。GO分析主要包括細(xì)胞組分、分子功能及生物過程，其中以生物過程最為關(guān)鍵。分析結(jié)果顯示，青黛可能參與的生物過程有131 條，主要包括對外源性凋亡信號通路的調(diào)節(jié)、對類固醇激素的反應(yīng)、對外源性凋亡信號通路的負(fù)調(diào)控、對雌二醇的反應(yīng)、對模式識別受體信號通路的調(diào)節(jié)、參與分化的細(xì)胞形態(tài)改變、對IL-1 的反應(yīng)等過程。使用R 軟件clusterProfiler 包對前10 位核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路信號富集分析，得到主要生物通路（圖5），P值越小，對應(yīng)的信號通路富集結(jié)果越好，圖5中所示與UC 密切相關(guān)的通路主要包括細(xì)胞凋亡、p53 信號通路、IL-17信號通路等。

圖4 青黛治療UC核心靶點(diǎn)的GO分析

圖5 青黛治療UC核心靶點(diǎn)的KEGG通路分析

3 討論

本研究篩選出青黛7 個活性成分，主要包括靛玉紅、β-谷甾醇、異維他嗪、6-（3-氧代吲哚-2-亞甲基）吲哚并[2，1-b]喹唑啉-12-酮等，這些成分即青黛治療UC 時發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。在得到的核心藥效成分中，靛玉紅和β-谷甾醇的研究最為廣泛。靛玉紅具有抑制細(xì)胞增殖、抗炎、抗腫瘤和抗病毒等生物學(xué)效應(yīng)[14]。有動物實(shí)驗(yàn)研究表明，靛玉紅具有抗UC 作用，且能促進(jìn)UC 大鼠緊密連接腸黏膜蛋白的表達(dá)[15]。李楠等[16]研究發(fā)現(xiàn)，靛玉紅能有效地緩解2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇誘導(dǎo)的UC模型大鼠的癥狀，其機(jī)制可能是通過下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、髓過氧化物酶（MPO）的表達(dá)水平，提高成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、ITF mRNA 表達(dá)水平，激活相關(guān)信號通路，進(jìn)而起到抗腸道細(xì)胞凋亡、抑制腸道炎癥、促進(jìn)UC 腸道受損黏膜修復(fù)的作用。β-谷甾醇對由TNBS 誘導(dǎo)的動物結(jié)腸炎也具有一定的抑制作用[17]。馮思敏等[l8]研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇能顯著抑制葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中IL-6 和環(huán)氧化酶-2（COX-2）的表達(dá)，降低結(jié)腸炎病理學(xué)評分。表明篩選出的青黛活性成分具有良好的抗UC作用。

藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)顯示，各節(jié)點(diǎn)之間相互作用，存在多種聯(lián)系。節(jié)點(diǎn)連線越多，連接度越大，則表明其在治療UC 時發(fā)揮的作用可能越大。將網(wǎng)絡(luò)圖通過拓?fù)鋮?shù)可視化后發(fā)現(xiàn)，青黛主要通過調(diào)控PTGS1、ESR1、AR、PRSS1、RELA、CASP3、CASP8、CASP9 等靶點(diǎn)發(fā)揮作用。而在諸多的核心靶點(diǎn)中，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對PTGS1、CASP3、ESR1、RELA 研究較多。根據(jù)GeneCard 數(shù)據(jù)庫顯示，PTGS1 亦稱為COX-1，普遍認(rèn)為COX-1 為要素酶或管家酶，其產(chǎn)生的前列腺素參與機(jī)體正常生理過程和保護(hù)功能，與炎癥產(chǎn)生無關(guān)。但有文獻(xiàn)指出，COX-1 不僅是要素酶，也是誘導(dǎo)酶。其參與炎癥反應(yīng)，并具有加重炎癥的作用[19]。然而，Peng 等[20]發(fā)現(xiàn)，無論是在UC 患者還是UC 小鼠的損傷階段，COX-1 含量均顯著降低，表明COX-1 也可能是UC的重要保護(hù)因素?；谝陨涎芯考捌渌墨I(xiàn)研究結(jié)論可知，COX-1 與UC 的關(guān)系尚不明確[21-22]，因此后續(xù)可通過基因靶向敲除實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究COX-1 與UC 的關(guān)系。UC 的發(fā)生與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[23]，腸黏膜細(xì)胞凋亡可造成腸黏膜通透性增加，腸道屏障功能降低，導(dǎo)致腸黏膜屏障破壞、受損或喪失，最終導(dǎo)致UC 的發(fā)生[24]。而CASP3、CASP8、CASP9均屬于Caspase蛋白家族成員，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激時，這些蛋白被系列反應(yīng)激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［25-26］。有多項(xiàng)研究表明，無論是UC 模型大鼠還是小鼠，其腸黏膜中CASP3 含量均顯著升高，且經(jīng)有效藥物處理后，CASP3 表達(dá)水平下調(diào)，結(jié)腸細(xì)胞凋亡率明顯下降[27-28]，表明CASP3、CASP8、CASP9 均與UC 發(fā)生相關(guān)，其中CASP3 作用最為關(guān)鍵。ESR1 是眾多雌激素受體中的一員，與雌激素結(jié)合后發(fā)揮作用。雌激素可能與炎癥性腸病的發(fā)生相關(guān)，因此激素受體也可與炎癥有關(guān)。李文欣等[29]利用TNBS/乙醇誘導(dǎo)制備大鼠炎癥性腸?。↖BD）模型，結(jié)果表明，與對照組比較，經(jīng)雌激素干預(yù)后IBD大鼠體質(zhì)量降低、疾病活動指數(shù)（DAI）評分增加、結(jié)直腸長度縮短、腸道炎癥加重，實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果顯示，雌激素可能通過與ESR1 結(jié)合促進(jìn)TNBS 誘導(dǎo)的IBD 的發(fā)生與發(fā)展，且ESR1 的激活能加重大鼠IBD 癥狀。RELA 是核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）家族重要的成員，前期已有大量研究表明，NF-κB 與UC 發(fā)病關(guān)系十分密切[30]，而RELA 經(jīng)翻譯后修飾可精準(zhǔn)調(diào)控NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性，在調(diào)節(jié)炎癥、腫瘤、代謝及免疫應(yīng)答等重要的生命活動及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用；同時，亦有研究表明，RELA 對NF-κB 進(jìn)行調(diào)控后可增加機(jī)體免疫能力[31]。因此，可推測青黛可能通過增強(qiáng)RELA 的表達(dá)，調(diào)控NF-κB 的活性及生物學(xué)功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能進(jìn)而起到抗UC作用。

生物功能分析結(jié)果顯示，青黛可能主要通過干擾外源性凋亡信號通路、調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)及參與對類固醇激素、雌二醇、IL-1 等反應(yīng)過程，最終通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡通路、p53 信號通路、凋亡-多物種信號通路、IL-17 等信號通路發(fā)揮抗UC 作用。對于信號通路而言，前20 條通路中與UC 相關(guān)的通路主要有凋亡、p53 信號通路、IL-17 信號通路。其中凋亡通路可能與CASP3、CASP8、CASP9 相關(guān)。此外，已有實(shí)驗(yàn)表明，IL-17信號通路的主要因子IL-17在UC的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位[32]，IL-17 表達(dá)水平下降提示病情緩解[33]；而p53 蛋白具有抑制細(xì)胞增殖功能，可使DNA 損傷的細(xì)胞生長停止于G1/G0期，然而UC 相關(guān)結(jié)直腸癌中p53基因突變率很高[34]。因此，推測青黛可能通過抑制細(xì)胞凋亡及IL-17信號通路起到抗UC 作用，并能同時通過抑制p53信號通路減少UC病變部位發(fā)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果表明，青黛主要從調(diào)節(jié)炎癥因子、細(xì)胞凋亡及防止癌變等方面發(fā)揮治療UC 的作用。其作用機(jī)制是多種生物學(xué)過程共同參與而成，體現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑、多通路調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)，為臨床利用青黛治療UC提供一定理論依據(jù)。然而，本研究主要依靠網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，研究所得核心成分與青黛入血實(shí)際發(fā)揮作用的成分是否一致尚未得到有效驗(yàn)證，因此，后續(xù)可從青黛入血成分等方面深入研究，以更好地闡述青黛治療UC的作用機(jī)制。