半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究△

盧玲，胡躍強(qiáng)，李歡，廖現(xiàn)秋，何乾超，蔡倫，刁麗梅*

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023

癲癇是大腦生理結(jié)構(gòu)或功能紊亂引起的一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，有超過(guò)半數(shù)的癲癇患者伴有1 種或多種并發(fā)癥[1]。精神疾?。ㄈ缫钟舭Y、焦慮癥、精神病、自閉癥）及軀體疾?。ㄈ? 型糖尿病、關(guān)節(jié)炎、消化道潰瘍、慢性阻塞性肺病）均與長(zhǎng)期的癲癇發(fā)作有關(guān)[2]。然而，長(zhǎng)期使用抗癲癇藥物不良反應(yīng)較大，且約有50%的患者單獨(dú)使用1 種抗癲癇藥物不能很好地控制癲癇發(fā)作[3]。大量的實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，中西醫(yī)結(jié)合治療癲癇效果優(yōu)于單純使用化學(xué)藥治療[4]。中醫(yī)認(rèn)為，癲癇與“風(fēng)”“瘀”“痰”“火”等病理因素密切相關(guān)。半夏白術(shù)天麻湯具有化痰熄風(fēng)、健脾祛濕之功用，臨床上可辨證用于治療“風(fēng)”“痰”所致的癲癇證型[5-6]。實(shí)驗(yàn)研究表明，半夏白術(shù)天麻湯可以通過(guò)干預(yù)微小RNA（miRNA）的表達(dá)，影響癲癇相關(guān)的生物學(xué)功能及信號(hào)通路，從而改善癲癇發(fā)作后的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗癲癇作用[7-8]。但是，半夏白術(shù)天麻湯中的活性成分治療癲癇的作用機(jī)制尚不明確。

近年來(lái)，以“多組分靶向網(wǎng)絡(luò)”為主要研究模式的中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)日益興起，其主要通過(guò)預(yù)測(cè)中藥化合物的靶向分布和藥理作用揭示藥物-基因-疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并詮釋中藥復(fù)方的配伍規(guī)律及作用機(jī)制[9-11]。本研究基于中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用的理念，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，研究半夏白術(shù)天麻湯的主要作用成分、靶點(diǎn)及其生物學(xué)功能及信號(hào)通路，以揭示其治療癲癇的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 中藥復(fù)方活性成分的收集

分別在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMANTCM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）及TCMID 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://119.3.41.228:8000/tcmid/）中，分別以“半夏”“白術(shù)”“天麻”“橘紅”“甘草”“茯苓”為關(guān)鍵詞，對(duì)半夏白術(shù)天麻湯中的每味中藥的化學(xué)成分進(jìn)行檢索，剔除重復(fù)部分。對(duì)在TCMSP中能夠檢索到的活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%[12]且類藥性（DL）≥0.18[13]為條件，篩選得到半夏白術(shù)天麻湯的活性成分。

1.2 藥物成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的收集

根據(jù)獲得的半夏白術(shù)天麻湯的活性成分，分別在TCMSP及BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得其成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白。再將靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入到UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）獲取每個(gè)靶蛋白所對(duì)應(yīng)的靶基因，即半夏白術(shù)天麻湯活性成分作用的靶點(diǎn)。

1.3 半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的潛在靶點(diǎn)獲取

通過(guò)OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/）和在線文本挖掘服務(wù)器GeneCards（https://www.genecards.org/），以“epilepsy”為關(guān)鍵詞檢索及去重后獲得癲癇相關(guān)靶點(diǎn)?；谠诰€軟件Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對(duì)半夏白術(shù)天麻湯成分作用的靶點(diǎn)及癲癇相關(guān)的靶點(diǎn)取交集，兩者共有的靶點(diǎn)即是半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的潛在靶點(diǎn)。

1.4 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的潛在靶點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的中藥活性成分整理成關(guān)系對(duì)文件，并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。獲得半夏白術(shù)天麻湯活性成分-癲癇靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。在Cytoscape 3.6.1 軟件中計(jì)算出網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度（degree）值。癲癇靶點(diǎn)的度值越大，表示作用于該靶點(diǎn)的中藥活性成分越多；半夏白術(shù)天麻湯活性成分的度值越大，則表示該活性成分可以作用的癲癇靶點(diǎn)越多。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析

將半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中，設(shè)定最高置信度為0.9，獲取網(wǎng)絡(luò)信息；將網(wǎng)絡(luò)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，使用CytoNCA 插件計(jì)算介數(shù)中心性（betweenness，BC），并構(gòu)建PPI核心子網(wǎng)絡(luò)，篩選出半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的核心靶點(diǎn)。

1.6 基因富集分析

在R 3.5.0 軟件中，基于clusterProfiler包[14]，對(duì)篩選得到的半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析。以P＜0.05 且Padjust＜0.05 為篩選條件，分別選取富集前20 位的GO條目及KEGG通路。

1.7 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將排名前20 位的KEGG 通路及癲癇相關(guān)靶點(diǎn)信息排列成關(guān)系對(duì)文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件中。計(jì)算出網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值，并且根據(jù)度值的大小調(diào)整節(jié)點(diǎn)的大小。

2 結(jié)果

2.1 半夏白術(shù)天麻湯活性成分及其靶點(diǎn)

對(duì)半夏白術(shù)天麻湯的每味中藥的成分進(jìn)行篩選后，得到半夏活性成分13個(gè)、白術(shù)7個(gè)、茯苓15個(gè)、甘草92 個(gè)、橘紅9 個(gè)、天麻46 個(gè)。剔除重復(fù)或者無(wú)固定結(jié)構(gòu)信息的成分后，得到半夏白術(shù)天麻湯的活性成分共130 個(gè)，部分活性成分的基本信息見(jiàn)表1。再 將130 種活性成分在TCMSP 及BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，獲得半夏白術(shù)天麻湯活性成分作用的靶點(diǎn)共446個(gè)。

表1 半夏白術(shù)天麻湯部分活性成分基本信息

2.2 半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的潛在靶點(diǎn)

通過(guò)OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)及GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)總共收集得到癲癇相關(guān)的靶點(diǎn)4620 個(gè)。使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)Venny 2.1 對(duì)癲癇相關(guān)的4620 個(gè)靶點(diǎn)及半夏白術(shù)天麻湯活性成分作用的446 個(gè)靶點(diǎn)取交集，共得到258 個(gè)半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的潛在靶點(diǎn)（圖1）。

圖1 半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的潛在靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的258個(gè)潛在靶點(diǎn)與活性成分匹配成關(guān)系對(duì)文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建得到半夏白術(shù)天麻湯活性成分-癲癇靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖2），并且計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值（表2）。結(jié)果表明，半夏白術(shù)天麻湯的多種活性成分可作用于同一個(gè)靶點(diǎn)；而同一個(gè)靶點(diǎn)也可匹配多種活性成分。進(jìn)一步闡明，半夏白術(shù)天麻湯通過(guò)多靶點(diǎn)、多成分對(duì)癲癇共同起治療作用。

表2 半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的核心靶點(diǎn)（度值≥30）

圖2 半夏白術(shù)天麻湯活性成分-癲癇靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析

將半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的258 個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)計(jì)算BC，獲得PPI 核心子網(wǎng)絡(luò)（圖3）。結(jié)果表明，半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的258 個(gè)潛在靶點(diǎn)間均存在直接或間接的相互作用。此外，β2腎上腺素受體（ADRB2）、鈣調(diào)蛋白1（CALM1）、雌激素受體1（ESR1）、一氧化氮合酶2（NOS2）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）不僅與半夏白術(shù)天麻湯的活性成分聯(lián)系密切，而且共同存在于PPI 核心子網(wǎng)絡(luò)中；其可能是半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的核心靶點(diǎn)。

圖3 半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇核心靶點(diǎn)的PPI核心子網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO分析和KEGG分析

對(duì)半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的258 個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因富集分析，GO分析的結(jié)果表明，生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能（MF）3 個(gè)部分都得到了顯著的富集。其中，包括類固醇代謝過(guò)程（steroid metabolic process）、對(duì)脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、對(duì)類固醇激素的反應(yīng)（response to steroid hormone）、對(duì)銨離子的反應(yīng)（response to ammonium ion）等生物學(xué)過(guò)程；A 型γ-氨基丁酸受體復(fù)合物（GABA-A receptor complex）、γ-氨基丁酸受體復(fù)合物（GABA receptor complex）、氯通道復(fù)合物（chloride channel complex）、突觸膜（synaptic membrane）、GABA 能突觸（GABA-ergic synapse）等細(xì)胞成分；神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動(dòng)（neurotransmitter receptor activity）、GABA-A 受體活動(dòng)（GABA-A receptor activity）、GABA 受體活 動(dòng)（GABA receptor activity）、GABA 門控的氯離子通道活性（GABA-gated chloride ion channel activity）等分子功能（圖4）。

圖4 半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇潛在靶點(diǎn)的GO分析

KEGG 通路富集分析的結(jié)果表明，篩選出的半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的潛在靶點(diǎn)可能通過(guò)參與神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligandreceptor interaction）、白細(xì)胞介素-17 信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、5-羥色胺能突觸（serotonergic synapse）、內(nèi)分泌的阻力（endocrine resistance）、催乳激素信號(hào)通路（prolactin signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）等通路及途徑發(fā)揮作用（圖5）。

圖5 半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇潛在靶點(diǎn)的KEGG通路富集

2.6 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖6）顯示，在半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的258個(gè)潛在靶點(diǎn)中，有144個(gè)靶點(diǎn)富集到了前20 條KEGG 通路上，其中包括ADRB2、CALM1、ESR1、NOS2、MAPK14 5個(gè)核心靶點(diǎn)。

圖6 半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇潛在靶點(diǎn)-KEGG通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

3 討論

半夏白術(shù)天麻湯出自《醫(yī)學(xué)心悟》，臨床上常用于治療癲癇、頭痛、高血壓及耳源性眩暈等[5]。研究發(fā)現(xiàn)，天麻的有效成分天麻素可明顯減少大鼠癲癇發(fā)作的頻率，改善腦電圖情況，對(duì)大腦具有保護(hù)作用[15]；甘草提取物中的甘草甜素和甘草黃酮具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠減少癲癇后的神經(jīng)損傷[16-17]；茯苓皮提取物及半夏提取物也具有抗癲癇的作用[18-19]。然而，半夏白術(shù)天麻湯發(fā)揮作用的活性成分及其作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)包括化學(xué)信息學(xué)、生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)和藥理學(xué)，是一種能夠揭示中藥方劑生物活性成分和潛在機(jī)制的研究方法[20]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對(duì)半夏白術(shù)天麻湯中的活性成分、作用靶點(diǎn)、靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系、靶點(diǎn)的生物學(xué)功能及富集的通路進(jìn)行綜合分析，探討半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，半夏白術(shù)天麻湯的活性成分中，能夠作用于較多癲癇相關(guān)靶點(diǎn)的活性成分主要有槲皮素、天麻素、γ-谷甾醇、山柰酚、羥基芐胺、柚皮素、甘草查耳酮A、山豆根堿、β-谷甾醇、黃芩素、對(duì)羥基甲醇等。在癲癇發(fā)生過(guò)程中，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞都發(fā)生了氧化應(yīng)激。研究表明，以氧化應(yīng)激為靶點(diǎn)的臨床藥物，可明顯減少癲癇患者的發(fā)作頻率[21]。槲皮素可能通過(guò)直接清除活性氧和調(diào)節(jié)抗氧化酶活性而發(fā)揮抗癲癇的作用[22]。天麻素可以明顯改善患者的氧化應(yīng)激的水平，減少癲癇患者腦部氧化應(yīng)激損傷[23]。山柰酚、槲皮素、黃芩素等黃酮類化合物可以與GABA-A 受體上的苯二氮卓類藥物位點(diǎn)相結(jié)合，保護(hù)大腦免受氧化應(yīng)激的傷害，發(fā)揮抗癲癇作用[24]。同樣，炎癥反應(yīng)在癲癇的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[25]。柚皮素能夠通過(guò)平衡GABA-A 受體，降低丙二醛和TNF-α水平，升高谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫水平，影響神經(jīng)炎癥從而發(fā)揮抗癲癇的作用[26]。c-Jun N 末端激酶（JNK）與神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，甘草查耳酮A 能夠選擇性地抑制JNK1，從而降低癲癇的嚴(yán)重程度和神經(jīng)元的損傷，減少細(xì)胞凋亡生物標(biāo)志物和神經(jīng)炎癥，發(fā)揮抗癲癇的作用[27]。

成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)綜合分析的結(jié)果顯示，ADRB2、CALM1、ESR1、NOS2、MAPK14 這5 個(gè)靶點(diǎn)可能是半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的核心作用靶點(diǎn)。有證據(jù)表明，ADRB2激動(dòng)劑能夠降低抗癲癇藥物的抗癲癇作用[28-29]。同樣，越來(lái)越多證據(jù)顯示，在癲癇患者嗅球組織中NOS2 表達(dá)上調(diào)[30]，且NOS2 可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)[31]。增強(qiáng)突觸刺激可以激活MAPK，最終導(dǎo)致癲癇的發(fā)作，而通過(guò)抑制MAPK通路可以減少癲癇所致的神經(jīng)元損傷[32-33]。此外，癲癇發(fā)作顯著抑制了突觸的可塑性，且短期可塑性主要取決于突觸部位鈣水平的波動(dòng)和穩(wěn)態(tài)[34]，ESR1 的神經(jīng)保護(hù)作用主要是通過(guò)對(duì)突觸的可塑性的影響[35]。

GO富集分析結(jié)果表明，半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇靶點(diǎn)的功能主要體現(xiàn)在對(duì)類固醇激素反應(yīng)、GABA-A 受體復(fù)合物、GABA 受體復(fù)合物、氯通道復(fù)合物、突觸膜、GABA 能突觸、神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動(dòng)、GABA-A 受體活動(dòng)、GABA 受體活動(dòng)、GABA 門控的氯離子通道活性、苯二氮卓受體活動(dòng)等方面，與文獻(xiàn)記載一致[36-39]。KEGG 通路富集分析結(jié)果表明，半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的信號(hào)通路主要有神經(jīng)活性配體-受體相互作用、IL-17 信號(hào)通路、5-羥色胺能突觸、內(nèi)分泌的阻力、催乳激素信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等。研究證實(shí)，神經(jīng)受體活性、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、膠質(zhì)細(xì)胞激活、突觸傳遞、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、突觸可塑性和神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)均與癲癇的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[40]。促炎性信號(hào)通路IL-17信號(hào)通路和腫瘤壞死因子信號(hào)通路在誘導(dǎo)血腦屏障破壞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身炎癥過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，參與了癲癇的“神經(jīng)免疫性炎癥”過(guò)程[41]。5-羥色胺是神經(jīng)元興奮性的有效調(diào)節(jié)因子，長(zhǎng)期以來(lái)的研究認(rèn)為，其可以控制癲癇的發(fā)作活動(dòng)，且動(dòng)物模型的證據(jù)表明，癲癇大鼠海馬組織中5-羥色胺的基礎(chǔ)水平和周轉(zhuǎn)率均低于正常大鼠，5-羥色胺能傳遞受到損害[42]。通過(guò)提高催乳素的水平可以抑制癲癇活動(dòng)[43]。此外，部分癲癇患者可伴有內(nèi)分泌系統(tǒng)的疾病，包括亞臨床甲狀腺功能減退、生長(zhǎng)減慢、體質(zhì)量異常、生殖和性功能障礙等[44]。綜上，半夏白術(shù)天麻湯活性成分作用的靶點(diǎn)的生物學(xué)功能及富集的信號(hào)通路，與文獻(xiàn)記載相吻合，進(jìn)一步表明半夏白術(shù)天麻湯對(duì)癲癇的治療是多通路共同起作用的結(jié)果。

本研究所獲得的半夏白術(shù)天麻湯的活性成分中，有多個(gè)活性成分均有減少氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)、減少神經(jīng)元損傷、干預(yù)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)GABA 等功能。而活性成分作用的核心靶點(diǎn)及潛在靶點(diǎn)的生物學(xué)功能、富集的信號(hào)通路均與氧化應(yīng)激過(guò)程、炎癥過(guò)程、突觸傳遞及GABA 能等神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，表明半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑共同起作用的。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，初步揭示了半夏白術(shù)天麻湯治療癲癇的作用機(jī)制，為拓寬半夏白術(shù)天麻湯在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的應(yīng)用提供了參考，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。