雷公藤多苷片中雷公藤甲素與體外肝毒性相關(guān)性研究△

王曼虹，王雪，顏玉靜，黃芝瑛，汪祺*，文海若*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.中山大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

雷公藤多苷片（TripterygiumGlycoside Tablets，TPT）由衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤去皮制備而成，具有較強(qiáng)的抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等藥理作用[1]，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征、自身免疫肝炎和皮膚病等均具有良好的治療效果[2]。但自TPT應(yīng)用于臨床以來，其不良反應(yīng)和器官毒性時有報道[3-4]，以肝臟毒性報道最為多見。如李紅剛等[5]發(fā)現(xiàn)，683 例服用TPT 的病例中110 例出現(xiàn)肝損傷，發(fā)生率約為16%，具體臨床表現(xiàn)為肝臟壓痛感、皮膚和尿液黃染、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平升高等。研究提示，其毒性作用機(jī)制可能與脂質(zhì)過氧化、肝細(xì)胞過度凋亡、免疫損傷、肝藥酶活性改變、糖和脂肪代謝異常等因素有關(guān)[6]。

TPT 所含成分復(fù)雜，主要成分包括生物堿、雷公藤甲素（triptolide，TP）、雷公藤內(nèi)酯甲（wilforlide A，WA）和雷公藤紅素等[7]。研究提示，TPT 中TP 活性最強(qiáng)，但因該成分同時具有較強(qiáng)的毒性作用[8-9]，《中華人民共和國藥典》2020年版中TPT將TP列為檢查項(xiàng)，規(guī)定其上限。前期采用國家藥品監(jiān)督管理局局頒標(biāo)準(zhǔn)（WS3-B-3350-98-2011）[10]對10個企業(yè)171批雷公藤多苷片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，市場上TPT 中TP 含量多寡各異，部分企業(yè)生產(chǎn)的TPT中甚至不含有TP。因此，TPT的毒性是否僅與TP有關(guān)成為亟待解決的問題。

本研究采用人源肝細(xì)胞系HepaRG 研究不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的TPT 的肝毒性差異，同時明確TPT 中主要成分TP與肝毒性的相關(guān)性，本研究結(jié)果將為完善TPT的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、臨床合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

VICTOR X5 型多功能酶標(biāo)儀（PerkinElmer 公司）；BD FACSCalibur 型流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；H500FR 型臺式高速冷凍離心機(jī)（Kokusan 公司）；7180 型全自動生化分析儀（日立公司）；PB203-N 型電子天平（Mettler-Toledo 公司）；CKX31 型顯微鏡（Olympus 公司）；SI-T246 Vortex-Ge 型渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；ND-2000 型分光光度計（Thermo Fisher Scientific 公司）；iBright 1500 型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Quantstudio DX 型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司）。

1.2 試藥

人源肝細(xì)胞系HepaRG 購自Thermo Fisher Scientific 公司，本研究所用細(xì)胞為第12～13 代。TP對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111567-201404，純度：99.8%）；TPT（涉及生產(chǎn)企業(yè)：A～G，此處以字母代表；H 為在G 企業(yè)產(chǎn)品中人為在66.67 mg·mL-1TPT 中添加TP 100 μg·mL-1，作為TP 毒性評價對照）；cell counting kit-8（cck-8，日本同仁化學(xué)研究所）；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司）；TRNzol 總RNA 提取試劑（天根生化科技有限公司）；PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR? Premix ExTaq?Ⅱ(Tli RNaseH Plus)、ROX plus、DL2000 DNA Marker（寶生物工程有限公司）；引物合成（北京Invitrogen公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞毒性考察

將處于對數(shù)生長期的HepaRG 細(xì)胞消化后，調(diào)整至5×104個/mL，在96 孔板中每孔接種約5000 個細(xì)胞，孵育18～24 h 后給藥。分設(shè)空白對照組（不含HepaRG 細(xì)胞）、溶媒對照組［0.5%二甲基亞砜（DMSO）］及不同濃度的給藥組［TP 及WA 濃度：5～320 nmol·L-1；TPT質(zhì)量濃度：根據(jù)各TPT給藥后細(xì)胞存活率，取半數(shù)抑制濃度（IC50）為中間濃度，并上下各設(shè)1 個濃度組］，于37 ℃、5% CO2的條件下孵育24 h 后，每孔加入CCK-8 檢測試劑10 μL，37 ℃避光孵育2 h 后用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm 波長處的吸光度值（A），按公式（1）計算細(xì)胞存活率。在進(jìn)一步毒性研究中，不同受試物的給藥濃度以IC50為中間濃度（高濃度時細(xì)胞存活率約為20%，低濃度時則約為70%）。

2.2 HepaRG細(xì)胞凋亡率考察

將處于對數(shù)生長期的HepaRG細(xì)胞消化后接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長覆蓋皿底80%～90%時給藥。分設(shè)溶媒對照組（0.5%DMSO）及不同濃度的給藥組（詳見2.1項(xiàng)），于37 ℃、5%CO2的條件下孵育24 h 后，收集上清液，并用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化細(xì)胞，合并收集于離心管中離心［4 ℃，3000 r·min-1，離心10 min（離心半徑為13.5 cm）］。細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2 遍后，每管加1×binding buffer 100 μL 重懸細(xì)胞，在避光條件下每管加Annexin V-FITC 10 μL 并孵育15 min。之后，每管加碘化丙啶（PI）5 μL，孵育5 min。孵育完成后每管加入1×Binding Buffer 400 μL稀釋，吹打混勻后轉(zhuǎn)移至流式管中，1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

2.3 HepaRG細(xì)胞生化指標(biāo)測定

細(xì)胞培養(yǎng)和給藥與2.2 項(xiàng)下方法相同。給藥處理結(jié)束后，樣本經(jīng)離心［4 ℃，3000 r·min-1，離心10 min（離心半徑為13.5 cm）］分離出上清液。使用全自動生化分析儀檢測上清液中AST、堿性磷酸酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）的水平。

2.4 HepaRG細(xì)胞因子水平測定

細(xì)胞培養(yǎng)、給藥及消化收集與2.2 項(xiàng)下方法相同。用TRNzol 總RNA 提取試劑提取細(xì)胞樣本的總RNA，以NanoDrop?ND-2000 測定總RNA 的濃度和純度。使用含gDNA Eraser 的PrimeScript ?RT reagent Kit 進(jìn)行cDNA 反轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)SYBR GreenⅠReal time PCR（內(nèi)參為18S rRNA 基因），檢測細(xì)胞樣本中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和γ-干擾素（IFN-γ）表達(dá)量的變化，引物序列設(shè)計見表1。

表1 實(shí)時定量PCR法細(xì)胞因子測定引物序列

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率、生化指標(biāo)水平、細(xì)胞因子水平等數(shù)據(jù)用（）表示。采用單因素方差分析對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)圖與統(tǒng)計結(jié)果經(jīng)GraphPad Prism 7軟件處理生成。

3 結(jié)果

前期采用國家藥品監(jiān)督管理局局頒標(biāo)準(zhǔn)（WS3-B-3350-98-2011）對10個企業(yè)171批雷公藤多苷片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上選取其中7家生產(chǎn)企業(yè)的TPT進(jìn)行進(jìn)一步研究。這7家生產(chǎn)企業(yè)TPT中，TP含量差異較大（表2～3）。以66.67 mg·mL-1TPT計，不同企業(yè)TPT中含有的TP質(zhì)量濃度在0～77.78 μg·mL-1，其中企業(yè)G的產(chǎn)品中TP質(zhì)量濃度為0 μg·mL-1[11]。

表2 不同生產(chǎn)企業(yè)TPT中TP含量（）μg/片

表2 不同生產(chǎn)企業(yè)TPT中TP含量（）μg/片

表3 不同生產(chǎn)企業(yè)每66.67 mg·mL-1 TPT中TP質(zhì)量濃度（）

表3 不同生產(chǎn)企業(yè)每66.67 mg·mL-1 TPT中TP質(zhì)量濃度（）

3.1 TP及TPT的細(xì)胞毒性

使用CCK-8 法測定HepaRG 細(xì)胞經(jīng)不同濃度（5～320 nmol·L-1）TP 處理24 h 后的相對細(xì)胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TP 的IC50約為15.14 nmol·L-1。以下研究重點(diǎn)考察不同生產(chǎn)企業(yè)TP含量與毒性差異之間的關(guān)聯(lián)。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所有企業(yè)的TPT 均可顯著降低HepaRG 細(xì)胞的存活率，且隨著TP 濃度增加，細(xì)胞存活率逐漸降低且存在濃度效應(yīng)相關(guān)性，見圖1。

圖1 TP及不同企業(yè)TPT對HepaRG存活率的影響

H為G企業(yè)樣品添加100 μg·mL-1TP的對照組，前者IC50低于后者（表4），提示TP 的加入可明顯增加TPT制劑的細(xì)胞毒性。

表4 不同企業(yè)TPT對HepaRG細(xì)胞IC50 μg·mL-1

3.2 TP及TPT對HepaRG細(xì)胞凋亡率的影響

細(xì)胞凋亡是藥源性肝損傷的重要作用機(jī)制之一，前期研究提示，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是TP 的藥效學(xué)及毒理作用機(jī)制之一[12]。本研究使用流式細(xì)胞計數(shù)法研究TP 對HepaRG 細(xì)胞凋亡率的影響，發(fā)現(xiàn)TP 濃度＞20 nmol·L-1（約為7.20 ng·mL-1）時可顯著升高HepaRG 細(xì)胞凋亡率（P＜0.001），且呈一定濃度效應(yīng)相關(guān)性（圖2）。

圖2 TP對HepaRG細(xì)胞凋亡率的影響（,n=3）

7 家生產(chǎn)企業(yè)TPT 的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除D 企業(yè)TPT中的低質(zhì)量濃度6.66 μg·mL-1（相應(yīng)TP質(zhì)量濃度為7.20 ng·mL-1，與TP 單獨(dú)給藥導(dǎo)致凋亡起始濃度一致）僅引起HepaRG 細(xì)胞凋亡率微弱上升外（D毒性最弱，TP 含量也最低），其他企業(yè)TPT 均自低濃度起即可引起HepaRG 的凋亡率顯著上升，且存在濃度效應(yīng)相關(guān)性（P＜0.05，P＜0.001，圖3）。結(jié)合不同TPT 中TP 濃度對HepaRG 細(xì)胞凋亡率的影響，TP 含量與HepaRG 細(xì)胞凋亡率有一定關(guān)聯(lián)，其中H 為G 的TP 添加對照，添加TP 后凋亡率相比G略有升高。然而C 企業(yè)樣品導(dǎo)致凋亡的起始濃度中含有的TP 經(jīng)折算約為10 nmol·L-1，低于TP 單獨(dú)給藥導(dǎo)致凋亡的起始濃度。此外，在不含TP 的情況下，G仍可導(dǎo)致HepaRG細(xì)胞的凋亡率顯著上升，提示TP并非TPT導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的唯一決定因素。

圖3 不同生產(chǎn)企業(yè)TPT（A～H）對HepaRG細(xì)胞凋亡率的影響

3.3 TP及TPT對HepaRG細(xì)胞生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)中，AST、ALP、LDH、GGT 及CK 升高均與肝毒性有關(guān)[13]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），TP 濃度＞20 nmol·L-1時可導(dǎo)致LDH 升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），質(zhì)量濃度＞40 nmol·L-1時可引起AST、ALP 升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；TP 在40 nmol·L-1時還可引起CK 的顯著升高（P＜0.05），在80 nmol·L-1時 可引起GGT 的顯著升高（P＜0.01），提示TP在不同濃度可導(dǎo)致不同程度的肝細(xì)胞功能異常。

圖4 TP對HepaRG生化指標(biāo)的影響（,n=3）

不同企業(yè)樣品的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5），來自B、E、F 和H 企業(yè)的TPT 均可不同程度引起AST、ALP、LDH、CK、GGT等指標(biāo)的升高，升高程度為H＞E＞B＞F；A 和C 企業(yè)的TPT 可引起AST、ALP、LDH、CK 的升高；G 企業(yè)的TPT 僅可引起AST、LDH 的升高，而D 企業(yè)TPT 對各個指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（D 中TP 濃度最低）；結(jié)合各TPT 的藥物濃度及TP 濃度，提示肝損傷的發(fā)生與TPT 中的TP濃度相關(guān)。實(shí)驗(yàn)為考察TP 的毒性作用，對比G 及人為添加TP 的對照H 樣本，添加TP 可導(dǎo)致AST 和LDH進(jìn)一步升高，提示TP是引起肝細(xì)胞損傷的重要因素；且TP 進(jìn)一步升高ALP 及CK 水平[13]從而對膽汁淤積與細(xì)胞能量代謝產(chǎn)生影響，但除此以外，TPT 中其他成分也存在一定肝毒性風(fēng)險。本研究結(jié)果提示，各企業(yè)的TPT 均有一定的肝損傷作用，且TP 含量與細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡、ALP、CK、TNF-α和IFN-γ變化直接相關(guān)，AST、LDH、TNF-α和IFN-γ是檢測TP導(dǎo)致的肝細(xì)胞毒性的較為靈敏指標(biāo)，且變化趨勢與文獻(xiàn)中體內(nèi)研究報道大致相符[14-16]。

圖5 不同生產(chǎn)企業(yè)TPT對HepaRG細(xì)胞生化指標(biāo)的影響（,n=3）

3.4 TP及TPT對HepaRG細(xì)胞因子水平的影響

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、血細(xì)胞生成、細(xì)胞生長及損傷組織修復(fù)等多種功能[13]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6 和TNF-α為對TP 毒性最為靈敏的指標(biāo)。TP濃度＞20 nmol·L-1時可顯著降低IL-6和TNF-α的水平（P＜0.001），濃度為20～40 nmol·L-1時可顯著升高IL-10及IFN-γ的水平（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，見圖6）。TP 可影響多種細(xì)胞因子分泌水平，從而介導(dǎo)抗炎和免疫抑制作用，上述結(jié)果與文獻(xiàn)報道基本相符[17-18]。

圖6 TP對HepaRG細(xì)胞因子水平的影響（,n=3）

如圖7 所示，來自7 個企業(yè)的TPT 均可降低HepaRG 細(xì)胞TNF-α的水平，且呈一定劑量效應(yīng)相關(guān)性；此外，部分企業(yè)的TPT（如A、B、C、E 和F）可升高IL-10水平。上述變化趨勢與TP的作用基本相符，提示TPT的抗炎與免疫抑制作用與TP含量有關(guān)。然而，部分企業(yè)的TPT（如A、B、D、G 和H）則誘導(dǎo)IL-6 的水平升高；部分企業(yè)的TPT（如A、B、C、E 和F）可顯著降低IFN-γ水平，但B、E、F 和H 企業(yè)的TPT 作用濃度較高時（細(xì)胞存活率低于50%）導(dǎo)致IFN-γ水平升高，提示其雖有一定的抗炎作用，但也有一定的肝損傷作用。上述變化與TP 單獨(dú)作用的結(jié)果不符，故推斷TPT 中其他成分，尤其是在其存在一定細(xì)胞毒性的濃度下，可能對TP的抗炎作用產(chǎn)生一定影響。

圖7 不同生產(chǎn)企業(yè)TPT對HepaRG細(xì)胞因子水平的影響（,n=3）

4 結(jié)論

TPT 是目前臨床廣泛使用的非甾體類免疫制劑[19]，其療效顯著，但臨床不良反應(yīng)不容忽視。據(jù)報道，TPT 的不良反應(yīng)發(fā)生率可達(dá)58.1%，主要表現(xiàn)為藥物性肝炎、肝功能異常等[20]。TPT 的不良反應(yīng)極大地限制了其臨床應(yīng)用。研究提示，TPT 所含有的二萜、三萜類化合物及苷類物質(zhì)均有一定的毒性[7]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)將TP 列為檢查項(xiàng)，控制其上限。然而，不同生產(chǎn)企業(yè)的TPT 中TP 質(zhì)量濃度差異顯著（0～77.78 μg·mL-1）[11]。盡管TP 藥效顯著，其毒性作用也不容忽視[21-22]。故將TP 含量控制在合理范圍內(nèi)是保障TPT 臨床有效性、安全性的重要基礎(chǔ)，本研究針對TP在TPT整體毒性中扮演的角色進(jìn)行了有益的探索。

綜上，本研究以HepaRG 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)TP 含量與TPT 的肝細(xì)胞毒性存在正相關(guān)，當(dāng)TP細(xì)胞給藥濃度低于20 nmol·L-1時，其細(xì)胞毒性不明顯，可作為其在藥物中含量限設(shè)定的參考。然而TP的含量并非TPT誘發(fā)肝細(xì)胞毒性的唯一決定性因素。如A 企業(yè)和C 企業(yè)的TPT 也表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性且AST等肝損傷指標(biāo)呈顯著性升高。然而兩者TP含量較低，其肝毒性與TP含量無必然關(guān)聯(lián)。因此，后續(xù)可針對TPT 中更多成分的肝損傷風(fēng)險展開研究。本研究結(jié)果將為完善TPT 質(zhì)量控制指標(biāo)、臨床合理應(yīng)用提供參考。