米諾環(huán)素通過Wnt/β-Catenin通路對大鼠牙髓干細(xì)胞成骨分化的影響

杜帥俠，姚秀翠，段 珂，王 靜

牙周病是一種常見的口腔疾病，會引起成人失牙，臨床上表現(xiàn)為牙齦出血、炎癥、牙槽骨吸收及牙齒松動移位等，嚴(yán)重影響患者正常生活。近年來，越來越多的學(xué)者展開了基于干細(xì)胞的骨組織工程相關(guān)研究，使骨再生成為可能。牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells, DPSCs)是一種間充質(zhì)干細(xì)胞，來源豐富、易于取材并且使用無倫理爭議，是骨組織工程的重要種子細(xì)胞[1-2]。Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-Catenin)信號通路是促進(jìn)組織損傷修復(fù)和再生的重要通路之一，在DPSCs成骨分化和牙齒生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用[3-4]。Wnt/β-Catenin信號通路激活后，會抑制糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)的磷酸激酶活性，拮抗β-Catenin的降解，使其大量聚集并進(jìn)入細(xì)胞核激活下游靶基因，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[5-6]。Mao等[7]研究表明，可通過調(diào)控GSK-3β/β-Catenin信號通路，在正畸過程中促進(jìn)牙齒移動部位骨形成，該通路可作為潛在的臨床牙科治療靶點(diǎn)。米諾環(huán)素(minocycline, MINO)是一種廣譜抗菌的四環(huán)素類抗生素，近年來研究者們發(fā)現(xiàn)它除了具有抗菌作用，還有抑制骨吸收、促進(jìn)新骨形成的作用[8]，但其作用機(jī)制尚未明確。據(jù)此，本研究擬采用不同劑量的米諾環(huán)素干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠牙髓干細(xì)胞(RDPSCs)，觀察并檢測RDPSCs成骨分化各項(xiàng)指標(biāo)以及Wnt/β-Catenin通路的變化，探討米諾環(huán)素對RDPSCs成骨分化的作用及機(jī)制，以期為RDPSCs應(yīng)用于牙周病治療的臨床研究提供一定科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RDPSCs購自上海ATCC細(xì)胞庫；米諾環(huán)素購自默克化工技術(shù)(上海)有限公司；DMEM培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)板購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)和0.2%胰蛋白酶溶液購自武漢普諾賽生命科技有限公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色試劑盒、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot, WB)二抗購自上海碧云天生物技術(shù)公司；骨鈣素試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；茜素紅、蛋白提取試劑盒和蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；RNA提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；ALP檢測試劑盒、β-Catenin抗體、GSK-3β抗體和Runx2抗體購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

生物安全柜購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma公司；臺式高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；Facscalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；垂直板電泳槽、蛋白轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將RDPSCs復(fù)蘇培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分為5組，每組6個(gè)平行對照，A組：對照組(不加米諾環(huán)素)；B組：0.1 mg/L米諾環(huán)素組；C組：1.0 mg/L米諾環(huán)素組；D組：10.0 mg/L米諾環(huán)素組；E組：100.0 mg/L米諾環(huán)素組。各組均加入成骨分化誘導(dǎo)液(每100 mL 10% FBS DMEM培養(yǎng)基中含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.2 mmol/L抗壞血酸和100 nmol/L地塞米松)。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率 將RDPSCs細(xì)胞以1×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后按照1.2.1中的分組進(jìn)行處理。分別在細(xì)胞培養(yǎng)1、7、14 d時(shí)，加入10 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育1 h，使用酶標(biāo)儀檢測每孔450 nm處OD值。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組-空白組)÷ (對照組-空白組)×100%。當(dāng)培養(yǎng)至7 d時(shí)，細(xì)胞增殖率最接近50%，選取7 d作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)。

1.2.3 測定細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性和骨鈣蛋白(OCN)含量 將RDPSCs細(xì)胞配制為2×105個(gè)/mL密度的單細(xì)胞懸液，2 mL/孔接種于6孔板中培養(yǎng)至貼壁，按照1.2.1中的分組進(jìn)行處理。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每3 d換液1次。棄去培養(yǎng)基后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止并4 ℃、1 500 r/min離心10 min，無菌PBS洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，隨后按照ALP檢測試劑盒或骨鈣素試劑盒說明書操作，于405 nm或450 nm處測OD值，計(jì)算ALP或OCN水平。

1.2.4 細(xì)胞ALP染色 取對數(shù)生長期的RDPSCs細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL的密度接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照1.2.1中的分組進(jìn)行處理，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)7 d，每3 d更換1次培養(yǎng)基。棄去培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌細(xì)胞3次，甲醛固定細(xì)胞后再次PBS洗滌，加入200 μL/孔的ALP染液，室溫避光顯色20 min，棄去染液后用PBS洗滌，晾干后于顯微鏡下觀察結(jié)果并記錄。

1.2.5 茜素紅S染色檢測細(xì)胞鈣鹽沉積量 將RDPSCs細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)至貼壁后按照1.2.1中的分組進(jìn)行處理。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)7 d，每3 d更換1次培養(yǎng)基。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞，固定細(xì)胞后進(jìn)行茜素紅S染色，PBS洗滌，顯微鏡下觀察并拍照，隨后用20%醋酸溶解，檢測每孔405 nm處OD值。

1.2.6 qRT-PCR檢測ALP和OCN mRNA表達(dá)情況 根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞中的總RNA，以其為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR檢測ALP和OCN mRNA表達(dá)情況，引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.2.7 WB檢測GSK-3β、β-Catenin和Runx2蛋白表達(dá)水平 在6孔板中接種2 mL密度為2×105個(gè)/mL的RDPSCs細(xì)胞，待貼壁后按照1.2.1中的分組進(jìn)行處理。培養(yǎng)7 d后棄去培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS終止后低溫1 500 r/min離心10 min，洗滌2次后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白并根據(jù)BCA試劑盒測定蛋白總濃度。后取50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束取出凝膠，使用電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶室溫封閉1 h，加入稀釋(1∶1 000)的對應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，棄去一抗溶液并洗滌PVDF膜，加入稀釋(1∶2 000)的二抗溶液，室溫?fù)u床1 h，洗膜3次，ECL顯色并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。F表示整個(gè)擬合方程的顯著性，F(xiàn)越大表示越顯著，擬合程度也就越好；P反映對照組與實(shí)驗(yàn)組差異大小，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RDPSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示：細(xì)胞形態(tài)以纖維狀為主，排列緊密且具有典型的旋渦狀特點(diǎn)，符合RDPSCs特點(diǎn)。

圖1 RDPSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)光鏡下觀察( ×200)

2.2 米諾環(huán)素對RDPSCs細(xì)胞增殖率的影響

結(jié)果顯示，與對照組相比，米諾環(huán)素各組細(xì)胞增殖率顯著升高(P<0.05)，14 d時(shí)，10.0 mg/L組相比0.1 mg/L組、100 mg/L組相均比1.0 mg/L組有所下降，如表2、圖2所示。

表2 米諾環(huán)素對RDPSCs細(xì)胞增殖率的影響

*：與A組相比，P<0.05

2.3 米諾環(huán)素對RDPSCs細(xì)胞ALP活性和OCN含量的影響

由結(jié)果可知，與對照組相比，0.1、1.0 mg/L米諾環(huán)素組ALP活性和OCN含量顯著升高(P<0.05)，10.0、100.0 mg/L米諾環(huán)素組ALP活性和OCN含量顯著降低(P<0.05)，如表3，圖3、4所示。

*:與A組比較，P<0.05

表3 米諾環(huán)素對RDPSCs細(xì)胞ALP活性和OCN含量的影響

2.4 米諾環(huán)素對RDPSCs細(xì)胞鈣鹽沉積的影響

結(jié)果顯示，與對照組相比，0.1、1.0 mg/L米諾環(huán)素組細(xì)胞鈣鹽沉積量明顯上升(P<0.05)，10.0、100.0 mg/L米諾環(huán)素組細(xì)胞鈣鹽沉積量明顯下降(P<0.05)，如表4，圖5、6所示。

比例尺：200 μm

*:與A組比較，P<0.05

比例尺：500 μm

表4 米諾環(huán)素對RDPSCs細(xì)胞鈣鹽沉積的影響

2.5 米諾環(huán)素對RDPSCs細(xì)胞ALP和OCN mRNA表達(dá)的影響

由結(jié)果可知，與對照組相比，0.1、1.0 mg/L米諾環(huán)素組ALP和OCN mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，10.0、100.0 mg/L米諾環(huán)素組ALP和OCN表達(dá)顯著降低(P<0.05)，如表5、圖7所示。

*：與A組相比，P<0.05

表5 米諾環(huán)素對RDPSCs細(xì)胞ALP和OCN mRNA表達(dá)的影響

2.6 米諾環(huán)素對RDPSCs細(xì)胞GSK-3β、β-Catenin和Runx2蛋白表達(dá)的影響

由結(jié)果可知，與對照組相比，0.1、1.0 mg/L米諾環(huán)素組GSK-3β蛋白表達(dá)量顯著降低，β-Catenin和Runx2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，10.0、100.0 mg/L米諾環(huán)素組GSK-3β蛋白表達(dá)量顯著升高，β-Catenin和Runx2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，如表6，圖8、9所示。

*：與A組相比，P<0.05

表6 米諾環(huán)素對RDPSCs細(xì)胞GSK-3β、β-Catenin和Runx2蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

牙周病可導(dǎo)致牙槽骨的病理性吸收，造成成人失牙。DPSCs增殖活性高，具有多向分化潛力，目前關(guān)于它的組織工程應(yīng)用研究主要集中在修復(fù)受損牙本質(zhì)、成骨分化和成神經(jīng)細(xì)胞分化等方面[9-13]， 為臨床口腔疾病的治療帶來希望。米諾環(huán)素是一種半合成的四環(huán)素類藥物，研究表明它能夠有效抑制牙周致病菌繁殖，消除細(xì)菌感染，抑制破骨細(xì)胞活性并減少骨吸收，還可以促進(jìn)牙周組織再生、新骨形成[14]。

圖9 米諾環(huán)素對RDPSCs細(xì)胞GSK-3β、β-Catenin和Runx2蛋白表達(dá)的影響

Tabatabaei等[15]發(fā)現(xiàn)，DPSCs可在體外被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，表達(dá)典型的成骨細(xì)胞標(biāo)志物ALP和OCN，產(chǎn)生礦化基質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素作用于成骨細(xì)胞后，可促進(jìn)細(xì)胞ALP和OCN表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、成骨分化和礦化[16]。米諾環(huán)素還可促進(jìn)損傷脊髓處骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的募集，并且促進(jìn)其體外增殖[17]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，0.1、1.0 mg/L米諾環(huán)素組牙髓干細(xì)胞的增殖率、骨形成指標(biāo)ALP和OCN含量、細(xì)胞鈣鹽沉積量均顯著升高，10.0、100.0 mg/L米諾環(huán)素組細(xì)胞增殖率較對照組顯著升高，骨形成指標(biāo)ALP和OCN含量及二者表達(dá)水平、細(xì)胞鈣鹽沉積量均顯著降低，提示低濃度的米諾環(huán)素對牙髓干細(xì)胞成骨分化起促進(jìn)作用，高濃度則起抑制作用，提示臨床用藥時(shí)應(yīng)注意把握劑量。

Wnt/β-Catenin信號通路參與調(diào)節(jié)多個(gè)生物過程，當(dāng)通路未激活時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的β-Catenin、GSK-3β和軸抑制蛋白(axis inhibitor, Axin)、腺瘤樣息肉蛋白(adenoatous polyposis coli, APC)結(jié)合形成四聚體，使得GSK-3β能夠持續(xù)磷酸化β-Catenin，磷酸化的β-Catenin在蛋白酶的作用下發(fā)生降解，Wnt信號通路就此被抑制；當(dāng)Wnt信號通路激活時(shí)，會產(chǎn)生傳導(dǎo)信號抑制GSK-3β、Axin和APC的活性，四聚體發(fā)生解離從而釋放β-Catenin，使得細(xì)胞質(zhì)中不斷積累β-Catenin，隨后未降解的β-Catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動Wnt信號通路下游靶基因Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(recombinant Runt related transcription factor 2, Runx2)[18-19]。Luo等[20]研究報(bào)道，激活Wnt/β-Catenin通路可抑制骨髓干細(xì)胞成脂分化，促進(jìn)其成骨分化。Jiang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的人牙周膜干細(xì)胞中加入雌激素，可激活Wnt/β-Catenin信號通路從而促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化。本研究結(jié)果顯示，與不加米諾環(huán)素的對照組相比，0.1、1.0 mg/L米諾環(huán)素組牙髓干細(xì)胞β-Catenin和Runx2蛋白水平顯著升高，GSK-3β蛋白水平顯著降低，而10.0、100.0 mg/L米諾環(huán)素組牙髓干細(xì)胞β-Catenin和Runx2蛋白水平顯著降低，GSK-3β蛋白水平顯著升高，表明低濃度的米諾環(huán)素可激活Wnt/β-Catenin通路，高濃度則可抑制Wnt/β-Catenin通路活化，與上述不同濃度米諾環(huán)素對RDPSCs成骨分化的影響一致。

綜上所述，米諾環(huán)素可通過調(diào)控Wnt/β-Catenin信號通路影響RDPSCs成骨分化，低濃度米諾環(huán)素促進(jìn)RDPSCs成骨分化，高濃度米諾環(huán)素則抑制RDPSCs成骨分化。本研究僅初步探討了米諾環(huán)素對RDPSCs成骨分化以及Wnt/β-Catenin信號通路的影響，RDPSCs的成骨分化還涉及Wnt信號通路與許多其他通路的共同協(xié)作，明確其中機(jī)制還需更深一步的研究。