聚乙烯醇-海藻酸鈉-改性沸石固定化菌球降解氨氮的研究

孫 霞，劉 揚，張 虎，王 芳，鄭福山

(1.山東江河濕地生態(tài)研究院，山東 濟南 271100；2.中國水利水電科學研究院，北京100038； 3.湖南百舸水利建設(shè)股份有限公司，湖南 長沙 410007)

隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展和人們生活水平的提高，氨氮污染的來源越來越廣泛[1-2]，含氨氮污水排入河流、湖泊，會導致魚類等水生生物因缺氧而死亡。因此，有效控制水體中的氨氮含量是水污染治理的重點。

目前已報道許多硝化細菌具有良好的降解氨氮性能[3-4]，但是由于細菌個體微小，難于固液分離，易隨水流流失，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。固定化技術(shù)將微生物細胞固定在載體內(nèi)，解決了固液分離困難的問題，而且具有生物負載量大、穩(wěn)定性高、不易造成二次污染等優(yōu)勢[5]。在固定化載體中，聚乙烯醇(PVA)軟硬程度可調(diào)，柔韌性能良好，但其傳質(zhì)性能較差；海藻酸鈉(SA)固定化成型方便，但其機械強度較差，易被微生物分解。當PVA和SA混合應(yīng)用時，可避免固定化菌球的拖尾，改善PVA的黏附聚集等問題，但仍存在機械強度差、受水力沖擊影響大等缺陷[6]。為此，研究者在PVA-SA混合載體中添加生物炭[7]、活性炭[8]及谷朊粉、聚丙烯纖維[9]等材料，來改善固定化菌球的性能。沸石具有較大的比表面積和發(fā)達的微孔結(jié)構(gòu)，對氨氮有較高的選擇吸附性[10]。用酸、堿、鹽及高溫等[11-13]方法對沸石進行改性處理，能大大提高沸石的吸附容量，增強對氨氮的去除能力。

目前，大規(guī)模應(yīng)用固定化菌球還存在易破碎、發(fā)脹、活性喪失等缺陷。作者以PVA-SA為包埋載體，改性沸石為吸附載體，硝化細菌Acinetobactersp.DT12-3為目標菌，采用吸附-包埋聯(lián)合固定化技術(shù)制備固定化菌球，探究包菌量、菌懸液濃度、固定化菌球投加量等因素對氨氮降解效果的影響，并評價固定化菌球的重復(fù)使用性，以期為固定化菌球技術(shù)處理氨氮提供參考。

1 實驗

1.1 材料與試劑

模擬水(g·L-1)：葡萄糖0.1，酵母粉 0.01，三水乙酸鈉 0.4，無水磷酸二氫鉀 0.002，氯化銨 0.06，硝酸鉀 0.02，氯化鈉 0.05。

改性沸石：稱取沸石(粒徑40～60目，國藥集團化學試劑有限公司)50 g，在500 ℃馬弗爐中灼燒2 h，在干燥器中冷卻，備用。

聚乙烯醇(PVA，聚合度1 788)，國藥集團化學試劑有限公司；海藻酸鈉(SA)，上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 菌株與培養(yǎng)基

硝化細菌Acinetobactersp.DT12-3由本實驗室篩選所得，最適生長溫度為30 ℃，最適pH值為7.2，培養(yǎng)12 h達到穩(wěn)定期。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g·L-1)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH值7.2。

1.3 固定化載體性能的測定

傳質(zhì)性能測定：將一定量的固定化載體放入滴加了3滴亞甲基藍溶液的50 mL蒸餾水中，室溫靜置24 h；以空白水為參比，在406 nm處分別測定放入和未放入固定化載體的亞甲基藍水溶液的吸光度值OD406，OD406值越低說明固定化載體的傳質(zhì)性能越好。

溶脹率測定：將固定化載體烘干1 h后，稱取一定量(W0)放入盛有碳酸氫鈉緩沖溶液(pH值7.5)的燒杯中，于30 ℃恒溫靜置直至溶脹平衡；分別在第6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h時將固定化載體從溶液中取出，濾紙吸干表面水分后稱重(Wt)，按下式計算溶脹率(SR,%)：

1.4 固定化菌球的制備

將保藏的硝化細菌Acinebactersp.DT12-3接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，30 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為0.8～1.0。將菌液在10 000 r·min-1下離心5 min，菌體用無菌生理鹽水洗滌2～3次，重懸成OD600值為1.5的菌懸液。稱取一定量的改性沸石加入到菌懸液中，30 ℃、120 r·min-1下吸附0.5 h。

參照李衛(wèi)東等[14]的方法，根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，取PVA 10 g溶于90 mL 90 ℃無菌水中，充分攪拌至完全溶解；再加入SA 1 g繼續(xù)攪拌至完全溶解，用水浴鍋將包埋液控制在35 ℃，靜置消泡后，將改性沸石和菌懸液投入到包埋液中，攪拌均勻，定容至100 mL；將制備好的固定菌液用注射器滴入2% CaCl2飽和硼酸溶液中交聯(lián)24 h；將小球過濾取出，并用無菌生理鹽水沖洗2～3次，得到形狀穩(wěn)定的固定化菌球，用濾紙吸干表面水分，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 固定化菌球降解氨氮的影響因素

1.5.1 包菌量對氨氮降解效果的影響

按1.4方法，將培養(yǎng)菌液用無菌生理鹽水重懸至OD600值為1.0，分別以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的包菌量(菌懸液與包埋液的體積比)制備固定化菌球，將固定化菌球加入到模擬水中，在30 ℃、120 r·min-1下振蕩培養(yǎng)，定時測定水樣中的氨氮濃度，計算氨氮去除率。

1.5.2 菌懸液濃度對氨氮降解效果的影響

按1.4方法，將培養(yǎng)菌液用無菌生理鹽水重懸至OD600值分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5(OD600值為1.5時濃度約為5×108CFU·mL-1)，在最佳包菌量條件下制備固定化菌球，將固定化菌球加入到模擬水中，在30 ℃、120 r·min-1下振蕩培養(yǎng)，定時測定水樣中的氨氮濃度，計算氨氮去除率。

1.5.3 固定化菌球投加量對氨氮降解效果的影響

在最佳包菌量和菌懸液濃度下制備固定化菌球，分別以5%、10%、15%、20%、25%、30%的投加量將固定化菌球加入到模擬水中，在30 ℃、120 r·min-1下振蕩培養(yǎng)，定時測定水樣中的氨氮濃度，計算氨氮去除率。

上述實驗均設(shè)3個平行樣，重復(fù)2次，結(jié)果取平均值。

1.6 固定化菌球的重復(fù)使用性檢測

在最佳條件下制備固定化菌球，以25%的投加量加入到模擬水中，分別在120 r·min-1振蕩條件下和靜置條件下培養(yǎng)24 h；將固定化菌球取出，用無菌生理鹽水洗滌1次，并用濾紙吸干表面水分再轉(zhuǎn)入新的模擬水中，重復(fù)數(shù)次，每次觀察并記錄固定化菌球的狀態(tài)，測定水樣中的氨氮濃度，計算氨氮去除率。

1.7 分析方法

采用納氏試劑分光光度法[15]測定氨氮濃度，計算氨氮去除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 改性沸石添加量對固定化載體性能的影響

前期預(yù)實驗從成球的難易程度、粘連狀況、彈性、穩(wěn)定性方面評價，當PVA質(zhì)量濃度為10%(g∶mL，下同)、SA質(zhì)量濃度為1%(g∶mL，下同)，用2% CaCl2飽和硼酸溶液交聯(lián)24 h時，得到的固定化菌球的性能最佳，平均直徑為2.95 mm，圓形或近圓形，無拖尾，無粘連現(xiàn)象。PVA 分子中含有大量的親水性羥基(-OH)，其交聯(lián)主要靠-OH進行，PVA濃度越高，小球內(nèi)部結(jié)構(gòu)越致密，傳質(zhì)性能越差[16]；而PVA濃度過低時，載體交聯(lián)效果差，菌體容易溢出。研究顯示PVA質(zhì)量濃度在8%～12.5%范圍內(nèi)[17-18]，成球效果較好。SA具有提高PVA機械強度、增大孔徑和韌性的作用，隨著SA濃度升高，稠度會增加，流動性變差，容易拖尾；而SA 濃度過低時， SA與Ca2+交聯(lián)度低，不易成球，機械強度下降。研究顯示SA適宜質(zhì)量濃度<2%[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，PVA質(zhì)量濃度為10%、SA質(zhì)量濃度為1%時，固定化菌球的成球效果較好。

沸石經(jīng)高溫改性，可去除沸石孔穴和通道中的有機物等雜質(zhì)，沸石的比表面積、孔徑及孔隙率增大，空間位阻變小，內(nèi)擴散速率加快[12]，因此在固定化載體中添加改性沸石，能提高固定化菌球的傳質(zhì)性能和吸附性能。結(jié)果表明，當PVA-SA包埋載體中添加2%的改性沸石，固定化菌球的傳質(zhì)性能和溶脹性能最佳，氨氮去除率最高；添加改性沸石24 h后，OD406值顯著降低，說明傳質(zhì)性能提高；但當改性沸石添加量>2%時，OD406值及氨氮去除率趨于平穩(wěn)(表1)，表明添加量為2%時，改性沸石達到吸附飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加添加量并不能提高傳質(zhì)性能和氨氮去除率。溶脹率是影響固定化菌球理化性質(zhì)的重要因素，溶脹過程其實是菌球內(nèi)部高分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)伸縮的過程，添加2%改性沸石的固定化菌球在24 h后達到溶脹平衡。

表1 改性沸石添加量對固定化菌球性能的影響

2.2 包菌量對氨氮降解效果的影響(圖1)

圖1 包菌量對氨氮去除率的影響Fig.1 Effect of volume ratio of bacterial suspension to embedded liquid on removal rate of ammonia nitrogen

由圖1可知，隨著包菌量的減少，即菌懸液在包埋液中的比例減小，氨氮去除率降低。當菌懸液OD600值為1.0時，菌懸液和包埋液體積比為1∶1制備的固定化菌球?qū)Π钡娜コЧ詈?，氨氮去除率達62.2%。

2.3 菌懸液濃度對氨氮降解效果的影響(圖2)

圖2 菌懸液濃度對氨氮去除率的影響Fig.2 Effect of bacterial suspension concentration on removal rate of ammonia nitrogen

由圖2可知，隨著菌懸液濃度的增加，氨氮去除率先升高后下降，當菌懸液濃度OD600值為1.5時，固定化菌球?qū)Π钡娜コЧ詈?，氨氮去除率達68.6%。可能是由于隨著菌懸液濃度的增加，固定在菌球內(nèi)的菌體增加，因而對氨氮的降解能力增強；但是隨著濃度繼續(xù)增加，進入菌球內(nèi)的菌體密度增大，由于競爭營養(yǎng)和溶氧，菌體無法較好地生長繁殖及代謝，導致氨氮去除效果下降。故，菌懸液最佳濃度OD600值為1.5。

2.4 固定化菌球投加量對氨氮降解效果的影響(圖3)

圖3 固定化菌球投加量對氨氮去除率的影響Fig.3 Effect of dosage of immobilized bacteria pellets on removal rate of ammonia nitrogen

由圖3可知，隨著固定化菌球投加量的增加，氨氮去除率先升高后下降，當投加量為25%時，氨氮去除率達到最高，為93.2%；當投加量增加到30%時，氨氮去除率下降至89.5%。分析原因認為，在一定投加量范圍內(nèi)，隨著固定化菌球投加量的增加，提供的作用位點數(shù)量隨之增加，因此氨氮去除率升高；而當固定化菌球投加量超過一定限度后，菌球密度增大，造成菌球內(nèi)的菌體無法得到充足的養(yǎng)分和氧氣，使其代謝變慢，有的甚至死亡，從而使得氨氮去除率下降。故，固定化菌球的最佳投加量為25%。

2.5 固定化菌球的重復(fù)使用性(圖4)

圖4 固定化菌球重復(fù)使用對氨氮去除率的影響

固定化菌球的重復(fù)使用性可以反映處理系統(tǒng)的穩(wěn)定性，對實際應(yīng)用十分重要。在120 r·min-1振蕩條件下(圖4a)，固定化菌球可重復(fù)使用6次(合計144 h)；隨著重復(fù)使用次數(shù)增加，氨氮去除率逐漸下降；重復(fù)使用4次后，固定化菌球結(jié)構(gòu)開始膨脹松散，但氨氮去除率仍達77.8%；隨后，固定化菌球出現(xiàn)膨脹及破碎的現(xiàn)象愈發(fā)明顯，重復(fù)使用6次后，約90%的固定化菌球出現(xiàn)破損，氨氮去除率由最初的92.7%降至70.3%。

在靜置條件下(圖4b)，固定化菌球可重復(fù)使用10次(合計240 h)；重復(fù)使用6次后，固定化菌球開始膨脹松散，但氨氮去除率仍達72.7%；重復(fù)使用10次后，約90%的固定化菌球出現(xiàn)破損，氨氮去除率降至58.5%。

由此可見，振蕩條件促使菌球間相互碰撞，加速了菌球的松散破損，使用次數(shù)僅能維持6次，而靜置條件下使用次數(shù)能增加到10次；但是兩種使用條件下，氨氮去除率均隨使用次數(shù)的增加而不同程度地下降，因此固定化菌球的穩(wěn)定性及機械強度有待進一步提高。

3 結(jié)論

以聚乙烯醇-海藻酸鈉-改性沸石為載體、自行篩選的硝化細菌Acinetobactersp.DT12-3為目標菌制備了固定化菌球。結(jié)果表明，在聚乙烯醇和海藻酸鈉復(fù)合載體基礎(chǔ)上添加2%的改性沸石，固定化載體的傳質(zhì)性能、溶脹性能最佳；當菌懸液與包埋液體積比為1∶1、菌懸液濃度OD600值為1.5、固定化菌球投加量為25%時，固定化菌球?qū)Π钡娜コ士蛇_93.2%；固定化菌球的重復(fù)使用性較好，在振蕩條件下，固定化菌球可重復(fù)使用6次，在靜置條件下，固定化菌球可重復(fù)使用10次，使用10次后氨氮去除率為58.5%。