耐藥性顳葉癲癇大鼠認知和焦慮及抑郁行為學變化及意義

張淑敏 石涌霏 王麗琨 任思穎 伍國鋒

癲癇是由神經元異常放電引起的一種常見的神經系統(tǒng)功能紊亂綜合征[1]，其中顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)是發(fā)病率最高的類型，極易轉變?yōu)槟退幮园d癇或稱難治性癲癇[2]，表現(xiàn)為不受藥物控制的長期反復的頑固性癲癇發(fā)作[3]。除反復癇性發(fā)作外，部分患者可能出現(xiàn)執(zhí)行能力減退、學習記憶障礙、智力下降等認知行為改變[4]，且這類患者自殘行為和自殺意念發(fā)生率也普遍較高[5]。癲癇發(fā)作的不可預測性對患者造成嚴重危害，其合并癥亦可能對癲癇患者的生存質量產生更大影響[6]。因此，不僅要關注癲癇患者臨床癥狀的改善，更需重視癲癇相關合并癥的研究與治療。目前，國內對TLE的系統(tǒng)性行為學研究較少，部分研究只對慢性期癲癇進行探討，尚未對癲癇的耐藥性與否做出細分。該研究通過構建TLE大鼠模型，觀察耐藥性癲癇大鼠的認知、焦慮、抑郁等行為學改變，旨在為探究耐藥性TLE對認知功能及焦慮、抑郁情緒障礙的影響提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物SPF級成年健康雄性SD大鼠80只，體重180～220 g，貴州醫(yī)科大學實驗動物中心購入。自然光照，自由進食水。

1.2 主要試劑及儀器包括：氯化鋰、鹽酸毛果蕓香堿(美國Sigma)，硫酸阿托品(哈爾濱三精藥業(yè))，苯巴比妥鈉(大連億德瑞公司)，苯妥英鈉(Aladdin，上海)，水合氯醛(科密歐，天津)，SuperMaze行為學分析軟件(欣軟，上海)，視頻監(jiān)控系統(tǒng)(HIKVISION，杭州)。

1.3 方法

1.3.1癲癇模型制備和分組：隨機抽取6只作為正常對照組，其余74只按文獻[7]方法制備癲癇模型。預先給予大鼠腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg)，18～20 h后正式造模，造模前30 min，腹腔注射硫酸阿托品1 mg/kg。采用小劑量多次腹腔注射毛果蕓香堿，首次劑量10 mg/kg，后每隔30 min按相同劑量追加，總量不超60 mg/kg，直至大鼠出現(xiàn)Racine分級標準中Ⅳ級及以上的持續(xù)性大發(fā)作，即癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)，SE持續(xù)60 min后給予水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射終止發(fā)作。正常組給予等量生理鹽水腹腔注射。2周后大鼠癲癇進入慢性期，出現(xiàn)慢性自發(fā)性癲癇發(fā)作(spontaneously recurrent seizures，SRS)者即為慢性癲癇大鼠[8]。慢性期開始對大鼠進行24 h視頻監(jiān)控，記錄大鼠SRS的次數(shù)、癲癇發(fā)作等級(Racine分級)及持續(xù)時間。2周結束后，出現(xiàn)SRS的大鼠給予腹腔注射苯巴比妥(25 mg/kg，1次/d)，治療14 d記錄發(fā)作情況。若治療后發(fā)作次數(shù)及持續(xù)時間降低50%以上，則判斷為對苯巴比妥治療敏感；若發(fā)作次數(shù)及持續(xù)時間降低少于50%，則繼續(xù)給予苯妥英鈉(75 mg/kg，1次/d，×14 d)治療，若發(fā)作次數(shù)及持續(xù)時間降低仍少于50%，則視為對兩種藥物耐藥，歸為耐藥大鼠，反之為藥敏大鼠[9]。

共誘發(fā)SE大鼠55只(74.32%)，SE后存活28只(50.91%)，發(fā)生SRS大鼠24只，藥物篩選過程中死亡3只，最終耐藥大鼠6只，藥敏大鼠15只。將6只耐藥大鼠納入耐藥組，從藥敏大鼠中隨機抽取6只納入藥敏組。

1.3.2曠場實驗：方形敞箱，底部等分成25個方格，中間9格為中央區(qū)。將大鼠從中心位置放入箱內，自由活動5 min，記錄大鼠在各區(qū)域的活動情況及站立、理毛、排便等行為。

1.3.3糖水偏好實驗：每籠大鼠給予2瓶純水，自由進食水；第2天將一瓶純水替換為1%(質量濃度)蔗糖溶液；第3天，禁食水24 h；第4天，給每只大鼠放置等量純水和1%(質量濃度)蔗糖溶液，隔12 h交換兩瓶位置，24 h后計算糖水偏好率。糖水偏好率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

1.3.4強迫游泳實驗：透明圓柱形桶中注水，深度約30 cm，水溫22～26℃。將大鼠放入水中適應訓練15 min，訓練完畢撈出吹干。24 h后，相同水深和溫度，將大鼠放入水中強迫游泳6 min，記錄5 min內大鼠在水中的不動時間。

1.3.5Morris水迷宮實驗：圓形水池分為4個象限，逃生平臺固定于其中一個象限。前4 d，每天將大鼠依次從4個象限放入水中，記錄120 s內站上逃生平臺所用時間(即逃避潛伏期)。若找到平臺，讓其停留15 s；未找到平臺，用木棒引導至平臺并停留15 s。第5天，撤除平臺，將大鼠從距原平臺最遠的象限放入水中，記錄120 s內大鼠穿越原平臺區(qū)域次數(shù)、進入目標象限(即原平臺所在象限)次數(shù)及在目標象限的停留時間。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 癲癇大鼠行為學變化耐藥組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、發(fā)作等級及持續(xù)時間均高于藥敏組(P<0.05)。結果見表1。

表1 兩組SRS大鼠癲癇發(fā)作情況比較

2.2 各組大鼠抑郁樣行為改變與正常對照組比較，藥敏組和耐藥組大鼠強迫游泳實驗不動時間長，糖水偏好率降低(均P<0.05)；與藥敏組比較，耐藥組大鼠強迫游泳實驗不動時間長，糖水偏好率低(均P<0.05)。結果見表2。

表2 各組SRS大鼠強迫游泳實驗不動時間和糖水偏好率比較

2.3 各組大鼠焦慮樣行為改變與正常對照組比較，耐藥組和藥敏組大鼠總運動距離增加，站立次數(shù)減少(均P<0.05)；與藥敏組比較，耐藥組總運動距離更長，站立次數(shù)更少(均P<0.05)。耐藥組理毛次數(shù)多于藥敏組和正常對照組(P<0.05)，而藥敏組理毛次數(shù)與正常對照組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。各組間進入中心區(qū)域次數(shù)比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結果見表3。

表3 各組SRS大鼠曠場實驗焦慮樣行為比較

2.4 各組大鼠認知功能改變Morris水迷宮實驗結果顯示，與正常對照組相比，藥敏組第3、4天逃避潛伏期延長(均P<0.05)，而耐藥組第1～4天逃避潛伏期均增加(均P<0.05)；與藥敏組比較，耐藥組第2～4天逃避潛伏期更長(均P<0.05)。在學習記憶測試中，耐藥組同樣表現(xiàn)出較正常對照組記憶功能更差、穿越原平臺區(qū)域次數(shù)和進入目標象限次數(shù)減少、停留時間縮短表現(xiàn)(均P<0.05)。結果見表4～5。

表4 各組SRS大鼠Morris水迷宮實驗逃避潛伏期比較

表5 各組SRS大鼠Morris水迷宮實驗學習記憶功能比較

3 討論

氯化鋰-毛果蕓香堿制備癲癇模型可模擬人類TLE的神經病變與行為學改變[7]。該研究結果顯示，癲癇大鼠在曠場實驗中總運動距離增加，耐藥性癲癇大鼠自主活動性明顯亢進，這種運動性躁動可能與癲癇發(fā)作過程中大腦谷氨酸等興奮性神經遞質增加導致神經興奮性增強有關[10]；耐藥組站立次數(shù)、進入中央區(qū)域次數(shù)減少及理毛次數(shù)增加，反映耐藥性癲癇大鼠探索性減弱及對空曠區(qū)域的緊張情緒增加，焦慮行為增強；強迫游泳實驗中耐藥組不動時間明顯延長，表現(xiàn)出放棄掙扎的絕望行為，提示抑郁程度更重。嚙齒類動物偏愛甜食，正常大鼠在純水和糖水中優(yōu)先選擇喝糖水，而抑郁嚙齒類動物優(yōu)先選擇糖水的欲望較低。該研究結果顯示，耐藥組大鼠的糖水消耗量減少，糖水偏好率降低，提示耐藥性癲癇大鼠的快感缺失加重，抑郁樣情緒更明顯。Morris水迷宮實驗中，耐藥性癲癇大鼠的學習和空間記憶能力較正常和藥敏大鼠明顯下降；各組大鼠逃避潛伏期均呈逐漸下降，但耐藥組大鼠下降高于其他兩組，需要更長的時間進行學習記憶，提示其認知功能減弱；撤去平臺后，耐藥組大鼠穿過平臺區(qū)域、進入目標象限次數(shù)及停留時間也明顯低于正常組和藥敏組，表明耐藥性癲癇大鼠對平臺所在位置的空間記憶能力下降?？臻g記憶能力主要是海馬依賴的記憶形式，海馬長時程增強(long-term potentiation，LTP)和長時程抑制(long-term depression，LTD)是學習記憶的生理基礎[11]，這種功能的受損很可能與耐藥性癲癇發(fā)展過程中海馬神經元丟失和LTP、LTD異常改變密切相關[12]。部分研究認為，抗癲癇藥物的使用可能會產生對認知功能的負面作用，多種抗癲癇藥物聯(lián)合使用會對認知功能產生更大的負面影響[13]，但也有研究表明，在中位有效劑量下，這兩種抗癲癇藥物的使用并不會對小鼠逃避潛伏期產生影響[14]。該研究結果顯示，耐藥組大鼠水迷宮實驗中的各指標表現(xiàn)均差于藥敏組，一定程度上表明耐藥性癲癇可導致大鼠認知功能受損加重。耐藥性癲癇的形成機制復雜，易并發(fā)認知障礙、情緒異常等多種合并癥，且對情緒、認知功能的損傷更重，這些合并癥與耐藥性癲癇之間可能具有雙向的生物學聯(lián)系或某些共同的因果機制，確切結果有待進一步研究。

綜上所述，該研究結果顯示，慢性癲癇會導致大鼠出現(xiàn)認知功能減退及產生焦慮、抑郁情緒等行為學改變，耐藥性癲癇可使認知功能受損、焦慮、抑郁程度加重。提高耐藥性癲癇合并癥的認識及深入研究耐藥性癲癇與其合并癥的共患病機制具有一定重要意義。