高效富集磷的周叢生物構(gòu)建及其特征分析

高孟寧 ，徐瀅 ，吳永紅

（1.土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008；2.湖北秭歸三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)系統(tǒng)水利部野外科學(xué)觀測(cè)研究站，湖北 宜昌 443605；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，北京 100049）

磷是一種生物圈內(nèi)廣泛存在的、生物體所必需的基本元素，在有機(jī)體的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用[1-2]。磷主要通過(guò)巖石的風(fēng)化侵蝕、礦石的開(kāi)采等自然或人為途徑移出而進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)，并參與地球各圈層內(nèi)部或?qū)娱g生物地球化學(xué)循環(huán)[3]。作為一種不可再生和替代的元素，有限的磷礦被開(kāi)采用于人類(lèi)的生產(chǎn)生活，包括制造磷肥、農(nóng)藥、洗滌劑等化工產(chǎn)業(yè)[4-5]。并在隨后參與的環(huán)境-生物-人體的循環(huán)過(guò)程中逐漸向土壤和海洋沉積，過(guò)量磷的輸入將造成土壤污染、水體富營(yíng)養(yǎng)化和水生生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能惡化，并最終危害生態(tài)環(huán)境，限制經(jīng)濟(jì)發(fā)展[6-7]。

周叢生物作為一種自然界廣泛存在的環(huán)境友好型生物磷捕獲微生態(tài)系統(tǒng)[8-9]，具有一定的環(huán)境適應(yīng)性和自我恢復(fù)能力[10]，是水生食物網(wǎng)的重要環(huán)節(jié)，影響著系統(tǒng)內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)鹽循環(huán)和能量流動(dòng)及其在水體-沉積物兩相界面的遷移[11-12]。周叢生物是生長(zhǎng)于土壤、巖石、秸稈等淹水基質(zhì)表面[13]，由自養(yǎng)和異養(yǎng)微生物群落、微型動(dòng)物及其表面裹挾著的胞外聚合物等非生物物質(zhì)組成，是有著復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的微生物聚集體[14-15]。特別是光合作用微生物作為周叢生物重要的微生物組成，影響著周叢生物捕獲和富集磷的能力。自然周叢生物有限的磷富集能力，難以實(shí)現(xiàn)其對(duì)污水中磷的持續(xù)去除。

斜生柵藻是廣泛存在的淡水藻類(lèi)，能夠產(chǎn)生較多的胞外聚合物增強(qiáng)藻細(xì)胞表面的黏附性，易附著于其他生物表面，具有較高的污水磷去除能力[16-19]。因此，為提高周叢生物富集磷的能力，本研究將斜生柵藻與周叢生物共培養(yǎng)，以形成新型的具有高效富集磷能力的人工周叢生物，并進(jìn)一步探究其高效捕獲富集磷的機(jī)制及新型人工周叢生物的特征。本研究的目的在于為含磷污水提供一種新型、高效的磷去除技術(shù)，為削減水體中磷的負(fù)荷服務(wù)，為農(nóng)業(yè)面源污染和水體富養(yǎng)化的治理提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

斜生柵藻（Tetradesmus obliquus）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)。培養(yǎng)基為BG11，培養(yǎng)條件：溫度25 ℃、光照強(qiáng)度2 000 lx。原種分離來(lái)源：1960年湖北黃石衛(wèi)校。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 人工周叢生物構(gòu)建

斜生柵藻培養(yǎng)液離心收集藻細(xì)胞，于Wood Hold培養(yǎng)基（WC）中培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，用無(wú)菌水按照ycell=（191.92×OD680-0.954 5）×105的吸光度與細(xì)胞濃度的關(guān)系，配制成濃度為1.5×108cell·mL-1的藻細(xì)胞懸液；同時(shí)選取周叢生物約1 g 置于新鮮的滅菌的WC 培養(yǎng)液中，另按照1∶100（V/V）接種處于指數(shù)生長(zhǎng)期的斜生柵藻懸液于培養(yǎng)裝置內(nèi)共培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1 800 lx，溫度（25±1）℃；待載體表面的周叢生物成片取下時(shí)，即形成新型的周叢生物。同時(shí)，取適量周叢生物與人工周叢生物，利用三維熒光光譜（3D-EEM，Three-Dimension excitation emission）和傅里葉紅外光譜（FTIR，F(xiàn)ourier transform infrared）測(cè)定其胞外聚合物（EPS）的特征。

1.2.2 磷富集試驗(yàn)

人工周叢生物進(jìn)行一周短期的磷富集試驗(yàn)，探究人工周叢生物富集磷含量的變化。高磷培養(yǎng)液的配制：以WC 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將其K2HPO4濃度提高至5 mg·L-1。原周叢生物與人工周叢生物均設(shè)置3個(gè)平行（1 g 周叢生物溶于100 mL 培養(yǎng)液）。一周的富集期間，每隔24 h取樣1次，將取得的培養(yǎng)液經(jīng)0.45 μm 的濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行磷濃度測(cè)定，并擬合周叢生物磷吸附曲線。通過(guò)光學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡（SEM，Scanning electron microscope）、X 射線能譜分析（EDX，Energy dispersive X-ray spectroscopy）分析周叢生物表面的結(jié)構(gòu)和磷素分布，同時(shí)選取原周叢生物為對(duì)照。

1.3 樣品測(cè)定

水體磷含量測(cè)定采用鉬銻鈧比色法。使用土壤DNA 提取試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.A.）進(jìn)行DNA 提取，然后由第三方測(cè)序公司完成周叢生物16S rRNA與18S rRNA的測(cè)序。周叢生物中EPS采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（CER，Cation exchange resin）提取，并采用蒽酮比色法和考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其胞外多糖和蛋白的含量[20]。3D-EEM 采用三維熒光分光光度計(jì)（Hitachi F-7000，日本）分析測(cè)定，掃描范圍為激發(fā)波長(zhǎng)（Excitation，Ex）200~450 nm，掃描間隔為 5 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（Emission，Em）為250~600 nm，掃描間隔為1 nm，掃描速率為2 400 nm·min-1。將透析后的EPS 溶液冷凍干燥，取適量干燥樣品壓片，采用傅里葉紅外光譜儀（Nicolet iS50，Thermo Fisher，美國(guó)）分析測(cè)定，F(xiàn)TIR 測(cè)定條件為：測(cè)試范圍 200~450 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32 次。同時(shí)，使用超高效液相色譜儀（Vanquish，Thermo Fisher，美國(guó)）進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式表示。水體磷含量數(shù)據(jù)分析由Excel 2013 完成。3D-EEM接近拉曼峰和瑞利散射區(qū)域的數(shù)據(jù)的校正及周叢生物群落結(jié)構(gòu)分析由R 4.0.3完成，并由MATLAB 2015完成三維可視化。FTIR及代謝組學(xué)數(shù)據(jù)由R 4.0.3完成并進(jìn)行可視化。采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行顯著性差異分析，P<0.05表示具有顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 周叢生物富集磷含量的變化

周叢生物富集磷含量的變化如圖1 所示，與原周叢生物相比，人工周叢生物磷富集能力顯著提高。7 d 的磷富集試驗(yàn)中，第1 d，對(duì)比原周叢生物（0.74±0.09）mg·g-1的磷富集能力，人工周叢生物富集磷的含量為（2.48±0.22）mg·g-1；第7 d，相較于原周叢生物（2.26±0.14）mg·g-1的磷富集含量，人工周叢生物富集磷的含量提高到（6.79±0.45）mg·g-1。此結(jié)果表明，斜生柵藻構(gòu)建的人工周叢生物對(duì)磷的富集能力優(yōu)于原周叢生物，可以用于污水中磷的去除。

2.2 周叢生物群落組成和豐度

斜生柵藻的加入改變了周叢生物微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成，如圖2（a）所示，周叢生物中原核生物主要由藍(lán)細(xì)菌、變形桿菌、擬桿菌及厭氧繩菌組成。與原周叢生物相比，人工周叢生物明顯提高了藍(lán)細(xì)菌和α-變形菌的相對(duì)豐度。藍(lán)細(xì)菌作為周叢生物主要的光合作用微生物，在以太陽(yáng)光為能量進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖的光合作用過(guò)程中可以大量吸收和同化水體中的磷，具有較高的磷富集能力。以上結(jié)果說(shuō)明，藍(lán)細(xì)菌相對(duì)豐度的提高，可以提升人工周叢生物群落富集磷的能力[21]。

圖2（b）中原周叢生物與人工周叢生物的真核生物群落組成和豐度顯示，旋毛綱和綠藻為主要真核生物。與原周叢生物相比，人工周叢生物中綠藻綱相對(duì)豐度顯著提高了177.6%。在周叢生物中，藍(lán)細(xì)菌和綠藻這類(lèi)光合作用生物可自身“奢侈”吸收磷，其光合作用會(huì)提高水體pH 值，并促進(jìn)周叢生物表面碳酸鈣沉淀，誘導(dǎo)鈣磷共沉積，從而表面富集磷[22]。此外，周叢生物中光合作用生物代謝和光合過(guò)程產(chǎn)生的氧氣、有機(jī)物為細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖提供氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而細(xì)菌則為光合生物提供其生長(zhǎng)所需要的碳源和維生素[23]。由此，人工周叢生物通過(guò)提高其光合作用生物的相對(duì)豐度增強(qiáng)其對(duì)磷的捕獲，同時(shí)還可以促進(jìn)周叢生物群落內(nèi)部生物之間的相互作用關(guān)系，增強(qiáng)周叢生物體系對(duì)磷的富集能力[24]。

2.3 周叢生物空間結(jié)構(gòu)特征

采用光學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡及X射線能譜儀（SEM-EDX）觀察周叢生物表面結(jié)構(gòu)及其元素分布，探究高效富集磷的人工周叢生物較原周叢生物表面形態(tài)學(xué)特征的變化。如圖3 所示，原周叢生物表面較為光滑，細(xì)胞排列疏松，且以絲狀藻細(xì)胞為主。而人工周叢生物表面較為粗糙，絲狀藻細(xì)胞周?chē)偳吨渌寮?xì)胞，細(xì)胞排列較為緊密，三維網(wǎng)狀孔隙度高，表面磷元素含量高且元素分布更加均勻。光學(xué)顯微鏡及SEM-EDX 的結(jié)果表明，人工周叢生物更為復(fù)雜的表面細(xì)胞結(jié)構(gòu)、更高的三維孔隙度、更多胞外聚合物的分布，為周叢生物提供了更多的捕獲磷的結(jié)合位點(diǎn)[25]。

2.4 EPS含量及其活性官能團(tuán)特征

EPS 在周叢生物磷捕獲中發(fā)揮著重要作用，是胞外磷捕獲的主要地點(diǎn)，可通過(guò)胞外多糖中部分帶電的糖殘基及胞外蛋白中一些帶電基團(tuán)的相互作用捕獲和富集磷[26]。如圖4 所示，與原周叢生物相比，具有高效富集磷能力的人工周叢生物的EPS 中蛋白含量顯著提高了84.6%，而胞外多糖含量變化幅度較小，提高了23.7%。與周叢生物吸附磷能力的變化一致，人工周叢生物EPS 中磷含量也顯著增加。這說(shuō)明人工周叢生物大幅提高了EPS的含量，從而提高了磷捕獲能力。

周叢生物EPS 中天然存在來(lái)自蛋白質(zhì)或腐植酸的熒光類(lèi)物質(zhì)，因此可利用EPS中天然熒光探針表征其與磷元素的分子間作用。如圖5（a）和圖5（b）所示，周叢生物EPS 的3D-EEM 光譜有A、B、C 3 個(gè)特征峰，Ex/Em 分別為260 nm/366 nm、230 nm/340 nm、225 nm/297 nm，主要是來(lái)源于蛋白質(zhì)中色氨酸和酪氨酸殘基[26-27]。從熒光強(qiáng)度可以判斷周叢生物EPS的3DEEM 光譜A 峰表征了色氨酸物質(zhì)，相較于B 峰和C 峰表征的酪氨酸類(lèi)物質(zhì)含量更高。高效富集磷的人工周叢生物，其A、B、C 特征峰的熒光強(qiáng)度較原周叢生物均有不同程度的增強(qiáng)，峰A、B、C 分別提高了6.4%、6.6%和3.7%，說(shuō)明人工周叢生物可以通過(guò)提升胞外蛋白中色氨酸類(lèi)物質(zhì)與酪氨酸類(lèi)物質(zhì)的含量提升其對(duì)磷的捕獲與吸附能力。

如圖5（c）和圖5（d）所示，原周叢生物和人工周叢生物與5 mg·L-1磷溶液混合振蕩反應(yīng)后，均不同程度地降低了A、B、C特征峰的熒光強(qiáng)度，說(shuō)明EPS與磷相互作用能誘導(dǎo)熒光猝滅。原周叢生物和人工周叢生物熒光的譜峰A、峰B 和峰C 分別下降了22.2%、37.8%、29.1%和14.2%、16.1%、19.6%，說(shuō)明磷與周叢生物EPS 形成了非熒光類(lèi)絡(luò)合物[28]。另外，熒光譜峰A、B、C的位置在磷的作用下也發(fā)生了小幅的紅移，特別是峰A 的Ex/Em 由原來(lái)的225 nm/297 nm 紅移到230 nm/296 nm。綜上所述，與原周叢生物相比，人工周叢生物通過(guò)提升胞外蛋白中色氨酸類(lèi)物質(zhì)與酪氨酸類(lèi)物質(zhì)的含量提升其對(duì)磷的捕獲與吸附能力。

3D-EEM 光譜證實(shí)了周叢生物EPS 中色氨酸類(lèi)物質(zhì)和酪氨酸類(lèi)物質(zhì)的殘基參與了EPS 與磷元素的相互作用。已知色氨酸類(lèi)和酪氨酸類(lèi)物質(zhì)殘基中存在官能團(tuán)—NH2和—COOH，因此結(jié)合FTIR 技術(shù)進(jìn)一步揭示周叢生物EPS 中與磷相互作用的色氨酸類(lèi)和酪氨酸類(lèi)物質(zhì)殘基的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。如圖6 所示，周叢生物EPS 在3 377 cm-1處的寬吸收峰，主要是EPS中纖維素上羥基（—OH）的伸縮振動(dòng)；2 927 cm-1與2 873 cm-1處的吸收峰則來(lái)自于飽和碳鏈上—CH2—的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)和對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)；1 655 cm-1和1 540 cm-1處的吸收峰分別來(lái)自典型的蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶和Ⅱ帶中C=O 和—NH2的伸縮振動(dòng)；1 074 cm-1處的吸收峰與多糖衍生物中C—O、C—O—C有關(guān)，該峰與1 655 cm-1和1 540 cm-1的峰同時(shí)存在，表明周叢生物EPS 中含有大量的羧基功能團(tuán)[29]。綜上，在周叢生物EPS 與磷元素的結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的活性官能團(tuán)為—NH2、—COOH和—OH。

2.5 人工周叢生物差異代謝路徑分析

為了進(jìn)一步探明人工周叢生物相比于原周叢生物具有更高效捕獲和吸收磷機(jī)制的原因，利用代謝組學(xué)對(duì)原周叢生物及人工周叢生物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了定量分析。如圖7 所示，在檢測(cè)到的510 多種代謝物中，9 種涉及到組氨酸代謝、硫氨酸代謝、維生素B6代謝的關(guān)鍵代謝物含量發(fā)生了明顯的變化，除代謝物鵝肌肽含量發(fā)生下調(diào)外，其他8 種代謝物（3-磷酸咪唑甘油、L-組氨醛、1-甲基-L-組氨酸、L-組氨酸、鳥(niǎo)酐酸酯、吡哆胺、吡哆醛和吡哆醇）含量均發(fā)生了上調(diào)。

根據(jù)前人的研究成果，周叢生物作為典型的藻菌共生體，藻菌關(guān)系的有益作用可改善整體群落功能。維生素B6是細(xì)菌為藻類(lèi)提供生長(zhǎng)以及維持形態(tài)的關(guān)鍵代謝物[30]。在周叢生物差異代謝路徑的分析中發(fā)現(xiàn)，與原周叢生物相比，人工周叢生物涉及維生素B6代謝路徑中的吡哆胺、吡哆醛和吡哆醇的含量均發(fā)生了上調(diào)。以上結(jié)果說(shuō)明，人工周叢生物通過(guò)上調(diào)維生素B6代謝，以增強(qiáng)細(xì)菌與藻類(lèi)之間的相互作用關(guān)系，進(jìn)而提高周叢生物對(duì)磷的捕獲和吸收能力。

在藻菌關(guān)系中，藻類(lèi)為細(xì)菌提供生長(zhǎng)所需的碳水化合物、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并通過(guò)釋放這些物質(zhì)吸引細(xì)菌，以增強(qiáng)周叢生物中細(xì)菌和藻類(lèi)的交流與合作，建立密切的相互關(guān)系[31-32]。同時(shí)，藻類(lèi)還可以分泌相關(guān)物質(zhì)，增加其生物膜的形成能力，進(jìn)而維持周叢生物中細(xì)菌與藻類(lèi)之間的互作關(guān)系[11]。如圖7 所示，與原周叢生物相比，高效富集磷的人工周叢生物涉及組氨酸代謝中的僅有鵝肌肽含量發(fā)生了下調(diào)，3-磷酸咪唑甘油、L-組氨醛、1-甲基-L-組氨酸、L-組氨酸、鳥(niǎo)酐酸酯的含量均發(fā)生了上調(diào)。綜上所述，與原周叢生物相比，人工周叢生物通過(guò)上調(diào)組氨酸代謝、硫氨酸代謝和維生素B6代謝，調(diào)節(jié)細(xì)菌與藻類(lèi)之間的相互作用關(guān)系，進(jìn)而提高其對(duì)磷的捕獲和富集能力。

3 結(jié)論

（1）以斜生柵藻構(gòu)建的新型人工周叢生物，顯著提高了原周叢生物對(duì)磷的捕獲和富集能力。在7 d的磷富集試驗(yàn)中，人工周叢生物的磷捕獲能力提高了200%。

（2）在影響周叢生物磷捕獲能力的相關(guān)因素中，人工周叢生物的綠藻相對(duì)豐度提高了177.6%，EPS中胞外蛋白含量提高了84.6%；胞外多糖和蛋白中的活性官能團(tuán)—COOH、—OH 和—NH 參與了EPS 與磷元素的結(jié)合。

（3）人工周叢生物通過(guò)提高影響細(xì)菌與藻類(lèi)之間相互作用的氨基酸和維生素代謝物質(zhì)的含量表達(dá)，增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境中磷的捕獲能力。