黑曲霉對生物炭中磷釋放及形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響

李涵，來張匯，吳代赦，2，吳山*

（1.南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院，南昌 330031；2.南昌大學(xué)鄱陽湖環(huán)境與資源利用教育部重點實驗室，南昌 330031）

生物炭是生物質(zhì)在無氧或缺氧條件下，慢速熱解得到的具有多孔結(jié)構(gòu)、大比表面積和高度芳香化的碳質(zhì)材料[1]。其具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和吸附容量，被廣泛應(yīng)用于土壤改良、溫室氣體減排和污染土壤修復(fù)等方面[2-3]。生物炭表面含有豐富的孔隙和含氧官能團，以及較高的陽離子交換量，因而對環(huán)境污染物具有較強的吸附能力[4-5]。生物炭對污染物的吸附性能主要受其理化性質(zhì)的影響，生物質(zhì)原料及熱解溫度是影響生物炭理化性質(zhì)的兩個重要因素[6]。如動物糞便中不存在木質(zhì)纖維素，動物糞便類生物炭含碳量明顯低于植物殘渣類生物炭，受有機碳含量影響，動物糞便生物炭的比表面積也低于同熱解溫度下的植物殘渣類生物炭[7]。同時，生物炭的灰分含量、pH、電導(dǎo)率、碳穩(wěn)定性和微量元素含量均受到熱解溫度的重要影響[8]。生物炭因含有較多的氮、磷、鉀而被認為是一種優(yōu)良的土壤改良劑[9]，其中磷的緩慢釋放既可以為農(nóng)作物提供生物有效態(tài)的磷元素，也可以與重金屬離子形成不溶性的磷酸鹽礦物，鈍化土壤中的重金屬。

作為一種植物營養(yǎng)元素，磷的生物有效態(tài)含量對植物可利用度具有重要影響。然而，農(nóng)業(yè)土壤中的總磷通常只有很小一部分被釋放出來，導(dǎo)致了土壤中有效態(tài)磷含量相對不足[10]。解磷微生物是指能夠?qū)⑼寥乐械碾y溶性化合態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可供植物吸收利用的可溶性磷的特殊微生物功能類群[11]。解磷微生物產(chǎn)生有機酸可將不溶性磷和有機磷礦化為磷酸根[12]，在不增加化學(xué)磷肥的情況下提高土壤磷元素含量，極大改善了植物的磷素營養(yǎng)狀況。同時，解磷微生物代謝產(chǎn)生的植酸酶、核酸酶和磷酸酶等可加速有機磷的分解[13]。解磷微生物中，解磷真菌單位時間內(nèi)分泌的有機酸量大，解磷能力強于解磷細菌[14]。解磷真菌的解磷性能也更穩(wěn)定，部分細菌在傳代培養(yǎng)后會逐漸喪失解磷能力，但真菌在數(shù)代之后依然保有優(yōu)秀的解磷能力[15]。

生物炭對土壤磷素養(yǎng)分的貢獻量取決于制備生物炭的原料類型和熱解溫度[16]。污水污泥和水稻秸稈自身含有大量的磷，以它們?yōu)樵现苽涞纳锾康牧自睾恳草^高[17-18]。熱解溫度是影響含磷化合物在生物炭中的聚合度和溶解度的決定因素，生物炭中磷的形態(tài)、晶體結(jié)構(gòu)會隨熱解溫度的升高而改變[19]。生物炭向土壤緩慢釋放磷元素，可以有效減少磷肥的施用量，降低磷肥對環(huán)境造成的污染[20]。值得注意的是，生物炭中的磷主要為生物有效性較低的磷，如Al/Fe 磷酸鹽和不溶性含磷礦物[21]。已有研究表明，土壤中的解磷微生物能夠分泌有機酸，促進難溶性磷酸鹽的溶解，它們也可能會促進生物炭中磷的釋放，從而提高土壤中植物有效態(tài)磷的含量。然而，目前大部分研究主要集中于天然土壤理化條件下生物炭中磷的釋放[22-24]，關(guān)于解磷微生物，尤其是解磷性能更加穩(wěn)定的真菌對生物炭中磷的釋放及形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響仍不清楚。因此，研究解磷微生物對不同生物炭中磷的釋放與形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響，對于在廢棄生物質(zhì)資源化利用與土壤改良領(lǐng)域選擇性制備生物炭具有重要意義。

本研究從土壤中篩選出一株解磷真菌，分別在400 ℃和700 ℃下制備了兩種生物質(zhì)來源（市政污泥和水稻秸稈）的生物炭，并以生物炭為唯一磷源培養(yǎng)解磷真菌，測定培養(yǎng)過程中體系磷濃度的變化，同時分析磷的存在形態(tài)，探討解磷微生物存在下不同生物炭中磷的釋放與形態(tài)轉(zhuǎn)化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

篩選解磷真菌的土壤樣品于2020 年5 月采集自南昌市紅谷灘區(qū)（115°47′31″~115°47′34″E，28°39′47″~28°39′49″N），采用“S”形布點采樣，采集表層0~10 cm 土壤樣品，快速運回實驗室后放置于冰箱4 ℃保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

NBRIP 液 體 培 養(yǎng) 基[25]：葡 萄 糖 10.0 g，MgCl2·6H2O 5.0 g，Ca3（PO4）25.0 g，（NH4）2SO40.1 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào) pH 為7.0~7.5，121 ℃滅菌 20 min。NBRIP 固體培養(yǎng)基：在NBRIP 液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加瓊脂粉2%，121 ℃滅菌20 min。PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL。生物炭培養(yǎng)基：將NBRIP 液體培養(yǎng)基中的Ca（3PO4）2替換為生物炭，其他不變。無磷培養(yǎng)基：減去NBRIP 液體培養(yǎng)基中的Ca（3PO4）2，其他不變。

1.1.3 生物質(zhì)原料

從南昌市朝陽污水處理廠收集污泥，靜置30 min后，棄上清液，然后在7 000 r·min-1下離心15 min，棄上清液，收集濃縮污泥，然后在60 ℃的烘箱中干燥12 h。最后將干燥的污泥研磨后過60目篩。

將水稻秸稈洗凈烘干，剪成3~4 cm 小段后用粉碎機破碎，然后將得到的秸稈粉過60目篩。

1.2 實驗方法

1.2.1 解磷微生物的分離及篩選

將采集的土壤樣品制成土壤懸液，稀釋后涂布于NBRIP 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。通過觀察菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈初步篩選解磷微生物。將篩選所得解磷微生物的孢子懸液或菌懸液接入無菌NBRIP 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后采用鉬銻抗比色法測定培養(yǎng)液中可溶性磷的含量。對比各菌株培養(yǎng)液中可溶性磷濃度的大小，篩選出高效解磷菌[26]。

1.2.2 解磷菌的鑒定

（1）解磷真菌DNA的提取

將純菌株在PDA 培養(yǎng)基中活化，按照真菌基因組DNA 抽提試劑盒說明書（上海生工生物工程公司）中的步驟提取基因組DNA，產(chǎn)物于-20 ℃保存。

（2）解磷真菌ITS基因序列測定

本研究采用真菌鑒定通用引物[27]ITS1（TCCG?TAGGTGAACCTGCGG）和 ITS4（TCCTCCGCTTATT?GATATGC）進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物于4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，用Blast 程序與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較分析，利用MEGA 7.0 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.3 生物炭的制備與表征

（1）生物炭的制備

分別以污泥和水稻秸稈為生物質(zhì)原料，將裝滿污泥或秸稈粉末的坩堝放入爐中。為了使坩堝內(nèi)的氧氣含量降到最低，將污泥壓實，并在坩堝上蓋上蓋子。升溫速率設(shè)定為20 ℃·min-1，400 ℃（700 ℃）下停留時間設(shè)定為2 h。當加熱后爐內(nèi)溫度低于50 ℃時，取出坩堝。待樣品冷卻后用去離子水沖洗生物炭，去除附著的小顆粒。洗滌后收集生物炭，用冷凍干燥機干燥，然后研磨過60 目篩并密封保存。經(jīng)以上熱解過程制備的污泥生物炭、水稻秸稈生物炭，分別記為SBC和RBC。

（2）生物炭的表征

采用比表面積與孔隙度分析儀（TriStar II 3020，Micromeritics Instrument Corporation，美國）對生物炭的比表面積及孔徑進行測定。

1.2.4 解磷微生物的培養(yǎng)

將黑曲霉在PDA 培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3 d，用0.9%的生理鹽水沖洗固體培養(yǎng)基表面，在含玻璃珠的錐形瓶中充分振蕩30 min，將霉菌的菌絲體打散，釋放出成熟孢子，最后用4 層無菌紗布過濾掉菌絲體。用血細胞計數(shù)板調(diào)節(jié)菌液濃度為1×106cfu·mL-1。將2 mL的接種物轉(zhuǎn)移到250 mL 以生物炭為唯一磷源的生物炭培養(yǎng)基中，在（25±3）℃、150 r·min-1的搖床上培養(yǎng)，以不加黑曲霉孢子作為對照，每組重復(fù)3次。

以8 d 為一個周期，在第一個周期內(nèi)每日取樣10 mL，之后的每個周期，在最后一日取樣10 mL。取樣后需重新添加無磷培養(yǎng)基，先停止振蕩，讓錐形瓶中的混合物沉淀30 min 以分離培養(yǎng)懸浮液和生物炭，然后將上層200 mL 含黑曲霉的培養(yǎng)液替換為200 mL 無磷培養(yǎng)基。新補充的培養(yǎng)基在振蕩器中繼續(xù)培養(yǎng)8 d，然后再次更換培養(yǎng)基。一共更換3 次培養(yǎng)基。由于污泥生物炭釋放的磷主要為正磷酸鹽、焦磷酸鹽和微生物磷[28]，同時解磷微生物可通過分泌有機酸和釋放磷酸酶等方式將不溶性磷和有機磷礦化為可溶性無機磷[12-13]。因此，本研究只考慮了正磷酸鹽、焦磷酸鹽和微生物磷3 種形態(tài)。將10 mL 樣品分為A、B 兩個子樣品，A 樣品用于測定總磷。B 樣品過 0.22 μm 濾膜，分為樣品 B1、B2 和 B3，樣品B1 和B2 分別用于測定總?cè)芙饬缀驼?，樣品B3 測定pH。

1.2.5 磷的濃度與形態(tài)的測定方法

樣品A用過硫酸鉀消解后，采用鉬酸銨分光光度法測定總磷。樣品B1 在過濾后用過硫酸鉀消解，再采用鉬酸銨分光光度法測定磷含量，即可得到總?cè)芙饬缀?。樣品B2 在同樣品B1 的方法中省去過硫酸鉀消解樣品的步驟即測得正磷酸鹽含量。培養(yǎng)基中焦磷酸鹽和微生物中磷的含量可由上述所測的數(shù)據(jù)計算得到[28]，焦磷酸鹽的含量是總?cè)芙饬着c正磷酸鹽含量之差，而微生物中的磷是總磷與總?cè)芙饬缀恐?。對照組中不含微生物，因此只需測定總磷與正磷酸鹽含量，釋放的焦磷酸鹽含量即為總磷與正磷酸鹽含量的差值。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷微生物的篩選與鑒定

利用NBRIP 固體培養(yǎng)基平板分離，獲得4株能產(chǎn)生解磷圈的微生物，包括1 株真菌和3 株細菌。將這4 種微生物分別在無機磷液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d 后，測定培養(yǎng)液中的可溶性磷濃度，結(jié)果表明其中真菌的解磷能力較強，達到586.0 mg·L-1，遠高于其他3 株解磷細菌（解磷能力僅為22.6、14.9、34.0 mg·L-1）。將該真菌菌株命名為PSF-1，對其進行進一步的分子鑒定和解磷特性研究。

用Blast 程序?qū)⒕關(guān)SF-1 基因序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較分析，結(jié)果顯示，PSF-1 的ITS序列與黑曲霉（Aspergillus niger）的序列具有高度同源性，相似度高達99%。利用MEGA 7.0 進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建（圖1），根據(jù)形態(tài)觀察和ITS 序列對比，鑒定PSF-1為黑曲霉。

2.2 生物炭的比表面積

由表 1 可知，BC700 的比表面積比 BC400 高，而兩種生物炭的平均孔徑受熱解溫度影響不同。兩種生物炭中，秸稈生物炭比表面積更大，平均孔徑遠低于污泥生物炭?？偪左w積則是污泥生物炭高于秸稈生物炭，BC700 高于BC400。這表明隨著熱解溫度升高，生物質(zhì)中微孔孔道拓寬，變?yōu)橹锌咨踔链罂住?/p>

表1 生物炭的孔結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Parameters of pore structure in biochar

2.3 黑曲霉存在下生物炭釋磷過程中體系pH的變化

4 種生物炭培養(yǎng)基中，RBC700 培養(yǎng)基初始狀態(tài)下呈堿性，其他3 種培養(yǎng)基則為弱酸性。在培養(yǎng)過程中，黑曲霉存在下4 種生物炭培養(yǎng)體系的pH 均大幅下降（圖2）。第一個周期內(nèi)，4 種培養(yǎng)基的pH 均在第6 d 時達到最低。第二個培養(yǎng)周期末的pH 較第一周期末小幅度下降，后續(xù)兩個培養(yǎng)周期末的pH 則保持穩(wěn)定。最后一個培養(yǎng)周期末的4種培養(yǎng)基中，SBC400培養(yǎng)基的pH 最高，為（1.74±0.02）；RBC700 培養(yǎng)基的pH 最低，為（1.48±0.01）。上述pH 的變化說明，在第一個周期內(nèi)黑曲霉釋放大量有機酸，隨著葡萄糖的不斷消耗，黑曲霉釋放有機酸的速度降低，在更換培養(yǎng)基補充葡萄糖和其他營養(yǎng)物質(zhì)后，黑曲霉能繼續(xù)釋放有機酸。因為更換的是無磷培養(yǎng)基，體系中的磷并沒有得到補充，黑曲霉新陳代謝受到限制，體系pH趨于穩(wěn)定。

2.4 生物炭培養(yǎng)基中總磷釋放量

隨著培養(yǎng)時間的延長，4 種生物炭釋放的總磷量逐漸增加。對比沒有黑曲霉的空白實驗發(fā)現(xiàn)，4 種生物炭培養(yǎng)基在黑曲霉存在下均顯著提高了總磷釋放量（P<0.05）（圖3）。無黑曲霉存在時，BC400 釋放的總磷量高于BC700，在同一熱解溫度下的兩種生物炭中秸稈生物炭釋放的總磷量顯著高于污泥生物炭（P<0.05）。黑曲霉存在下，污泥生物炭的磷釋放量則明顯高于秸稈生物炭（P<0.05），SBC700 在黑曲霉的作用下磷釋放量可達（78.55±1.06）mg·g-1，遠高于RBC700 的（3.64±0.05）mg·g-1。黑曲霉作用下，SBC700 的 磷 釋 放 量 顯 著 高 于 SBC400（P<0.05），SBC700 在32 d 時的總磷釋放量比SBC400 高46.0%。而黑曲霉存在時熱解溫度對秸稈生物炭的影響不顯著，32 d 時 RBC700 總磷釋放量比 RBC400 僅高出5.23%。

2.5 黑曲霉存在下生物炭中磷的形態(tài)轉(zhuǎn)化

為了解黑曲霉存在下生物炭中磷的形態(tài)轉(zhuǎn)化，本研究測定了黑曲霉培養(yǎng)過程中SBC400釋放的不同形態(tài)的磷含量。研究結(jié)果表明，無黑曲霉存在時，SBC400 釋放的磷主要為焦磷酸，正磷酸所占比例小于20%（圖4a）。在黑曲霉存在下，SBC400 釋放的磷主要為正磷酸（圖4b），培養(yǎng)1 d 時，SBC400 體系中正磷酸占總磷的44.9%，培養(yǎng)2 d 時正磷酸占總磷的88.3%，培養(yǎng)32 d 后體系中正磷酸比例達到了97.2%；焦磷酸鹽含量在培養(yǎng)過程中先升高后降低，在第7 d時達到最高值（1.78±0.96）mg·g-1，然后在第8 d 時降低至（0.01±1.00）mg·g-1，后續(xù)兩個周期焦磷酸鹽含量小幅度回升。整個培養(yǎng)周期中，黑曲霉存在體系中焦磷酸鹽的含量顯著少于空白實驗（P<0.05），這可能是因為黑曲霉將體系中的焦磷酸鹽吸收轉(zhuǎn)化；微生物磷一直小幅度增長，說明有一部分的焦磷酸鹽被黑曲霉利用于自身的生長繁殖。

3 討論

本研究從土壤中篩選出一株高效解磷菌株P(guān)SF-1，鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger）。黑曲霉是一種解磷能力較強的溶磷菌株，在培養(yǎng)過程中，隨著黑曲霉菌絲的生長，其對不溶性磷酸鹽的溶解能力增強[29]。PSF-1 的解磷能力較強，以磷酸鈣為唯一磷源培養(yǎng)7 d 后培養(yǎng)基中的磷濃度可達到586 mg·L-1，與其他研究篩選得到的黑曲霉解磷能力相近。胡南等[30]從尾礦淤泥中篩選出的黑曲霉在以磷礦粉為唯一磷源培養(yǎng)22 d 后，培養(yǎng)基中的磷濃度可達到242 mg·L-1。在另一項研究中，孫冉等[31]通過單孢株篩選得到解磷能力較強的黑曲霉，其在液體培養(yǎng)基中的解磷能力在第4 d達到平穩(wěn)，為617 mg·L-1。

生物炭的原料類型及熱解溫度決定其孔隙結(jié)構(gòu)、表面官能團等性質(zhì)，這些性質(zhì)影響著生物炭在微生物活動及土壤物質(zhì)交換中的作用[32]。本研究中，BC700比BC400 的比表面積更大（表1），使其可以充分地與微生物接觸，從而釋放出更多的磷。此外，當生物炭施用于土壤時，其多孔性和吸附性可以使土壤中的磷在得到保存的同時緩慢釋放，避免磷被生物利用而快速消耗。

無黑曲霉存在下，秸稈生物炭的磷釋放量高于污泥生物炭，BC400磷釋放量高于BC700（圖3），這可能是因為BC400 中磷的聚合度較低[28]，更容易釋放。而黑曲霉作用下，污泥生物炭磷釋放量高于秸稈生物炭，BC700 磷釋放量高于BC400。通常，磷含量較高的生物質(zhì)制備的生物炭含磷量也較高，因此使用污泥、豬糞[20]等磷含量較高的原料制備的生物炭改良劑可以有效補充土壤中的磷元素。從實驗結(jié)果看，熱解溫度對污泥生物炭中磷的釋放有較大影響，但對秸稈生物炭的釋磷效應(yīng)影響較小，總體上，在黑曲霉作用下熱解溫度高的生物炭能釋放出更多的磷。有研究表明，700 ℃熱解制備的污泥生物炭釋放出的磷最多，因其含有較多的FePO4和AlPO4等酸溶性磷酸鹽，而更高熱解溫度制備的污泥生物炭中會產(chǎn)生既不溶于水也不溶于稀酸的Fe2P，導(dǎo)致生物炭中磷的釋放量下降[17]。

通常生物炭中的磷大部分不能直接釋放到環(huán)境中，但是這些磷可能會被解磷微生物轉(zhuǎn)化利用。在復(fù)雜的土壤環(huán)境中，解磷微生物分泌的有機酸在生物炭表面為磷的釋放創(chuàng)造了一個酸性微環(huán)境[19]。解磷微生物可以通過分泌低分子量有機酸溶解無機磷，通過釋放磷酸酶、植酸酶等分解有機磷[33-34]。已有研究表明，在解磷微生物的多種解磷機制中，有機酸的溶解占主導(dǎo)作用，解磷微生物在培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生草酸、檸檬酸等多種有機酸，有機酸陰離子與磷酸鹽礦物中的磷酸根發(fā)生離子交換，從而釋放出磷[35]。與對照實驗相比，本研究中含有黑曲霉的4 種生物炭培養(yǎng)體系pH 均大幅下降，說明黑曲霉在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了有機酸，這可能是葡萄糖氧化過程中產(chǎn)生的葡萄糖酸向培養(yǎng)物中釋放H+，使得體系pH下降[36]。因此，黑曲霉分泌的有機酸與生物炭表面的（焦）磷酸根之間的陰離子交換作用，可能是其促進生物炭中磷釋放的主要機制。

對于磷的存在形態(tài)，本研究發(fā)現(xiàn)無黑曲霉存在時SBC400 釋放的磷主要為焦磷酸，黑曲霉存在下SBC400 釋放的磷主要為正磷酸（圖4）。焦磷酸和土壤中有機磷（如植酸）的磷酸基團的鍵合方式相似[28]，因此解磷微生物分泌的磷酸酶也可能參與焦磷酸鹽的水解，將焦磷酸轉(zhuǎn)化為正磷酸。同時，微生物磷一直小幅度增長，表明一部分磷作為營養(yǎng)元素被用于黑曲霉的生長繁殖。有研究表明，解磷微生物能吸取環(huán)境中的磷并將其轉(zhuǎn)化為有機磷和聚磷酸鹽儲存在細胞中[37]，然后通過降解聚磷酸鹽釋放正磷酸鹽。在磷的各種形態(tài)中，正磷酸鹽的生物有效性最高[38]，因而黑曲霉將各種不溶性的磷轉(zhuǎn)化為正磷酸鹽，這可以提高土壤中磷的生物有效性，有利于土壤中植物的生長。

4 結(jié)論

（1）從土壤中篩選得到一株具有解磷能力的黑曲霉（Aspergillus niger），并成功鑒定與培養(yǎng)。

（2）污泥生物炭比秸桿生物炭釋放出更多的磷，表明磷含量較高的生物質(zhì)所制備的生物炭中可釋放的磷含量也較高；同時，較高的生物質(zhì)熱解溫度有利于生物炭中磷的釋放。

（3）黑曲霉可以促進生物質(zhì)炭中磷的釋放，促進焦磷酸鹽轉(zhuǎn)化為正磷酸鹽，提高生物質(zhì)炭有效態(tài)磷的含量。