前臂同種異體移植大鼠模型的建立

朱海男 顧斌 謝峰

帶血管復(fù)合組織同種異體移植(Vascularized composite tissue allotransplantation，VCA)是一個新的有前景的移植醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可以用來治療嚴(yán)重的、無法用傳統(tǒng)重建方法修復(fù)的軟組織損傷。目前，這項技術(shù)已經(jīng)在世界范圍內(nèi)的很多國家開展，許多不同種類的組織或器官被成功移植，比如手移植、前臂移植、面部移植、腹壁移植、氣管移植等[1-4]，其中上肢移植是開展最多的VCA移植類型。

然而，不同于實質(zhì)性器官的移植，包括上肢移植在內(nèi)的VCA仍然被認(rèn)為處于實驗階段，目前僅個別患者接受了此類手術(shù)。原因是大部分的VCA是用于改善生活質(zhì)量，而非拯救生命；另外，患者術(shù)后必須應(yīng)用具有各種副作用的免疫抑制劑。這類手術(shù)對患者的風(fēng)險和收益應(yīng)在術(shù)前進(jìn)行謹(jǐn)慎且全面的評估。目前，還需要大量的實驗研究來減少VCA手術(shù)面臨的風(fēng)險，為VCA真正應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。

大鼠個體較小，容易操控，價格較低，遺傳背景相對固定，被廣泛地應(yīng)用于VCA實驗[5-9]。但目前還沒有大鼠的肢體移植模型，為此我們嘗試建立該移植模型，以期為今后開展同種異體前臂移植的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和實驗設(shè)計

近交系雄性Brown Norway(BN)大鼠(基因表達(dá)：RT1n)，體質(zhì)量250～275 g，用作供體(n=8)；近交系雄性Lewis大鼠(基因表達(dá)：RT1l)，體質(zhì)量250～275 g，用作受體(n=8)。供受體大鼠均購自上海斯萊克實驗動物有限公司。供者大鼠在移植物被取下后使用過度異氟烷吸入的方法處死，隨后使用脫頸椎的方法確認(rèn)死亡。受者大鼠在術(shù)前、術(shù)后即刻和術(shù)后4 d給予止痛藥美洛昔康(2 mg/kg)。本研究共進(jìn)行了8例前肢的同種異體移植。受者鼠與供者鼠之間跨越了完全的主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)屏障。其中，3例受者鼠在術(shù)后未接受免疫抑制治療，設(shè)為對照組；5例受者鼠在術(shù)后給予劑量遞減的免疫抑制劑CsA(Novartis Pharma Schweiz AG，Switzerland)直到實驗結(jié)束，以防止免疫排斥反應(yīng)，設(shè)為實驗組。CsA給予劑量：第一周16 mg/kg·d，第二周8 mg/kg·d，第三周4 mg/kg·d，第四周及以后2 mg/kg·d。本研究獲上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 建立動物模型方法(圖1)

1.2.1 供者鼠手術(shù)

受者鼠的切口線包括圍繞肘關(guān)節(jié)的環(huán)形切口，上臂正面、前臂正背面的3條正中線切口。在上臂近端1/3處確認(rèn)和離斷3條前臂的主要神經(jīng)，即尺神經(jīng)、橈神經(jīng)和正中神經(jīng)。隨后，在上臂前面向下追蹤正中神經(jīng)和尺神經(jīng)直到肘關(guān)節(jié)水平。在肘關(guān)節(jié)水平，從尺神經(jīng)溝內(nèi)游離并前置尺神經(jīng)。橈神經(jīng)同樣被追蹤，深入到二頭肌和肱骨后向外側(cè)走行直到肱骨的三角突，在這里橈神經(jīng)被游離并前置。游離腋動靜脈和肱動靜脈從肘關(guān)節(jié)水平直到進(jìn)入胸壁段。隨后在起始處離斷伸肌和屈肌肌群。所有的肌肉連同血管蒂和神經(jīng)從尺橈骨骨膜下層被掀起直到二頭肌止點水平。術(shù)中應(yīng)特別注意確認(rèn)和保護(hù)骨間血管，需要小心地從骨面剝離骨間血管。隨后，使用直徑0.35 mm的鉆頭在尺骨上鉆2個小孔，鉆孔位置大約在骨離斷位置遠(yuǎn)端1～2 mm，隨后在骨間膜近端離斷尺橈骨。在顯微鏡下打磨平整離斷平面。最后，取下的移植物被包在鹽水紗布中，放入50 mL離心管，保存于4 ℃冰箱，等待移植。

A：取下的移植物；B：受區(qū)準(zhǔn)備；C：骨固定、神經(jīng)吻合和肌肉群修復(fù)后；D：切口關(guān)閉。A: Harvested graft; B: Preparation of the recipient; C: After bone fixation, nerve anastomosis and muscular reconstruction; D: Closure of the wound.圖1 大鼠前肢同種異體移植模型的建立Fig.1 Establishment of a rat model of forelimb allotransplantation

1.2.2 受者鼠準(zhǔn)備

切口線包括前正中切口和前臂近端1/3處的環(huán)形切口。確認(rèn)尺神經(jīng)、正中神經(jīng)和橈神經(jīng)并向下追蹤到肘關(guān)節(jié)水平后離斷。另外，橈神經(jīng)由后方前置到前方。屈肌和伸肌肌群在前臂近端1/3處離斷，并在骨膜下平面從尺橈骨表面剝離下來直到二頭肌止點位置。受者的二頭肌和三頭肌止點被完整保留，以維持肘關(guān)節(jié)的活動功能。在尺骨上打2個直徑0.35 mm的小孔，位置為骨離斷平面近端1～2 mm，隨后在骨間膜近端位置離斷尺橈骨。

在頸部另行一2 cm長切口。暴露頸外靜脈并將其作為受體靜脈。在胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)找到頸內(nèi)動脈并將其作為受體動脈。接著，在盡可能遠(yuǎn)的位置同時結(jié)扎、離斷動靜脈，目的是保留盡可能長的受者血管蒂，方便吻合。頸內(nèi)動脈通過頸部肌肉的隧道穿到上臂前面位置，目的也是延長血管蒂，方便吻合。

移植前，供者的前臂和切下的受者前臂并列放在一起，以調(diào)節(jié)兩者長度，確保移植后肢體的長度合適。

1.2.3 移植物的植入

對受者鼠和供者鼠的橈骨骨髓腔使用27號針頭進(jìn)行擴髓，隨后使用適當(dāng)長度的27號針作為髓內(nèi)針，將兩側(cè)橈骨連接起來。通過之前鉆的0.35 mm直徑小孔，用0.2 mm的鐵絲連接受者和供者尺骨。7-0單根絲線縫合受者伸肌和屈肌肌群的相對應(yīng)部分。隨后3根神經(jīng)以端端吻合的方法依次進(jìn)行吻合。使用11-0顯微縫合線進(jìn)行血管的端端吻合，最后使用4-0可吸收線縫合切口。

1.3 大體評估和移植物的組織學(xué)評估

術(shù)后觀察移植前臂的存活情況、免疫排斥反應(yīng)情況、感覺運動恢復(fù)情況。術(shù)后90 d時進(jìn)行移植物組織學(xué)觀察。

術(shù)后每天對移植前臂的血供、免疫排斥反應(yīng)情況(包括顏色的變化、水腫情況、有無變硬等)進(jìn)行觀察。術(shù)后每周記錄移植前臂的運動和感覺恢復(fù)情況。前肢的運動恢復(fù)包括步態(tài)和在日常生活中是否使用移植的前肢。移植前臂的感覺恢復(fù)通過指壓實驗確定。術(shù)后90 d，存活移植物取材，切片，HE染色，鏡下觀察，評估移植物組織學(xué)改變。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)一般情況

供者鼠的平均手術(shù)時間為2 h，受者鼠的平均手術(shù)時間為4 h，熱缺血時間為30 min。所有受者鼠都能較好地耐受手術(shù)。

A：術(shù)后12 d對照組移植物；B：術(shù)后20 d對照組移植物；C：術(shù)后1個月實驗組移植物；D：術(shù)后3個月實驗組移植物組織學(xué)評估。A: Graft in control group on POD 12; B: Graft in control group on POD 20; C: Graft in experimental group on POD 30; D: Histological observatin of the graft in experimental group on POD 90.圖2 術(shù)后移植物觀察Fig.2 Postoperative graft observation

2.2 大體觀察(圖2)

實驗組術(shù)后7 d內(nèi)術(shù)區(qū)水腫明顯，其中小部分皮膚發(fā)生表皮溶解壞死。但在脫痂后直到實驗結(jié)束為止，所有移植物的皮膚保持顏色粉紅、質(zhì)地柔軟，提示所有移植物的血供良好。所有移植前臂的指甲和毛發(fā)在術(shù)后20～25 d內(nèi)重新開始生長。術(shù)后，受者鼠沒有發(fā)生自噬移植物的現(xiàn)象。實驗過程中前臂的連續(xù)性保持良好，沒有發(fā)生前肢的關(guān)節(jié)僵硬。其中，肩關(guān)節(jié)和肘關(guān)節(jié)活動在術(shù)后10 d恢復(fù)正常，并在之后保持了正常的關(guān)節(jié)活動度。腕關(guān)節(jié)和指關(guān)節(jié)在術(shù)后2～3個月開始出現(xiàn)肌肉震顫，到實驗結(jié)束時，仍沒有恢復(fù)正常的大幅度關(guān)節(jié)運動。但是，受者鼠在術(shù)后1～2個月，開始在日?；顒又惺褂靡浦驳那氨?，例如捧食物、撓臉等。感覺的恢復(fù)，即觸覺或保護(hù)性收回運動在術(shù)后4～6周出現(xiàn)。實驗組有1只大鼠在術(shù)后75 d出現(xiàn)排斥反應(yīng)，表現(xiàn)為皮膚變紅，表皮剝脫伴散在細(xì)小出血點。但通過重新加大CsA劑量到8 mg/kg·d，并逐漸遞減到2 mg/kg·d，排斥反應(yīng)很快得到控制。

對照組，即受者鼠未接受免疫抑制治療組，移植物在術(shù)后早期獲得存活，術(shù)后12 d開始出現(xiàn)持續(xù)加重的紅腫，后逐漸出現(xiàn)皮膚溶解、壞死，肢體變黑，最終萎縮并木乃伊化。

2.3 組織學(xué)評估(圖2)

組織學(xué)檢測顯示，實驗組移植物內(nèi)骨組織結(jié)構(gòu)正常，骨細(xì)胞活力好，沒有缺血壞死，吸收等情況；骨髓結(jié)構(gòu)正常，可見大量正常骨髓細(xì)胞；移植物內(nèi)肌肉組織、皮膚組織、皮膚附屬器、皮膚下筋膜組織、肌腱等結(jié)構(gòu)無明顯異常。表明移植物血供可靠，且沒有發(fā)生明顯排斥反應(yīng)。

3 討論

自Dubernard等于1998年在法國里昂第一次成功完成了手移植，至今全世界范圍內(nèi)已經(jīng)進(jìn)行了超過100例手或前臂的移植手術(shù)。但是，由于術(shù)后需要長期使用免疫抑制劑治療，使得這一能顯著提高患者生活質(zhì)量的新技術(shù)至今無法在臨床得到全面開展[10]。

各種VCA相關(guān)研究中，實驗動物模型具有非常重要的作用，例如移植后的排斥現(xiàn)象、缺血再灌注損傷、開發(fā)更低毒性的免疫抑制劑、更好的組織保存方法等。目前還沒有前臂移植的大鼠模型。雖然在已發(fā)表的VCA模型中，有一些模型提供了與前臂相同或者相似的組織構(gòu)成，例如后肢移植模型、髂骨肌皮瓣模型、帶神經(jīng)的面部移植模型[11-12]。尤其是1978年建立的后肢移植模型，是最早發(fā)表的VCA模型，之后又陸續(xù)發(fā)表了許多該模型的改進(jìn)模型。這一模型對VCA的相關(guān)研究，包括不同的免疫抑制的方案、嵌合問題、移植物抗宿主反應(yīng)、免疫耐受誘導(dǎo)等都具有重要意義[13-17]。然而，大鼠的前肢和后肢存在諸多不同。在功能上，后肢主要負(fù)責(zé)承重和跑動，包括了更多的大塊肌肉組織，而前肢更多負(fù)責(zé)精細(xì)運動。另外，后肢包括更粗大強壯的骨結(jié)構(gòu)，尤其是股骨，是最為常用的帶血供的骨髓移植模型。也就是說，后肢移植與前肢移植相比，往往帶入大量的骨髓組織。而骨髓在移植后的移植物排斥、免疫耐受等現(xiàn)象中都起到較大的作用[18-20]。前肢和后肢同樣存在不同的神經(jīng)支配和血供系統(tǒng)，并且前肢和后肢中各種組織成分的比例不同。所有的不同均可能導(dǎo)致實驗結(jié)果的不同。

基于Greens[21]《大鼠的解剖》一書和針對大鼠前肢和后肢的解剖學(xué)研究，大鼠的前肢和人的上肢具有高度相似性，包括極其相似的骨骼肌肉系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)。因此，我們認(rèn)為使用大鼠前肢移植模型應(yīng)該能更好地研究上肢移植的相關(guān)基礎(chǔ)問題。

建立大鼠的前臂移植模型主要有兩個關(guān)鍵點：骨的固定和血管蒂的設(shè)計。在骨的固定中，有兩個因素需要考慮，即固定的平面和固定的方法。出于對肘關(guān)節(jié)功能完整性的考慮，本研究中我們保留了上臂的所有肌肉，所以前臂的截骨平面設(shè)計在肱二頭肌的止點遠(yuǎn)端，在移植物切取過程中要特別小心，不要損傷骨間血管，因為這一血管對尺橈骨的營養(yǎng)非常重要，并且非?？拷哦^肌止點的位置。我們需要小心地將骨間血管從尺橈骨上剝離下來，直到骨間膜的位置，隨后在骨間膜平面進(jìn)行截骨。動物實驗中使用過的骨的固定方法包括克氏針[16,22]、由注射針改成的髓內(nèi)針[18,23]和細(xì)鋼絲[24]。本研究動物模型中使用的固定方法是髓內(nèi)針和鋼絲固定的組合，其中髓內(nèi)針可以防止截骨部位的成角畸形，鋼絲固定可以防止截骨部位的分離畸形，兩者可共同防止旋轉(zhuǎn)畸形。由于大鼠的尺橈骨非常小，在顯微鏡下進(jìn)行骨面的平整對于接合后的牢固度非常重要。

肱血管的管徑非常細(xì)小(約0.4～0.5 mm)，直到與自肩胛下的血管匯合后到達(dá)胸壁表面時，才明顯變粗(約1 mm)。我們發(fā)現(xiàn)這一動脈與頸內(nèi)動脈的口徑相似，雖然同一平面的腋靜脈會比供區(qū)的頸外靜脈粗一些、薄一些，但是由于供者鼠與受者鼠的血管管徑都較粗，靜脈的吻合通常不是問題。合適的血管蒂的張力主要通過控制移植物長度來獲得，要盡量切取較長的受者和供者的血管蒂。因為頸內(nèi)動脈位置較深，我們通常在頸部和肩縫位置打通肌肉下隧道后穿過頸內(nèi)動脈到前臂位置進(jìn)行吻合，而不是將頸內(nèi)動脈跨過這些肌肉后進(jìn)行吻合。有時候，我們會臨時將移植的前臂固定到胸壁，保持前臂的內(nèi)收位置，以免術(shù)后外展造成對血管的過度牽拉。

遞減劑量的CsA治療是在VCA實驗中被廣泛應(yīng)用的免疫抑制劑方案，本研究進(jìn)一步確定了這一方案的可行性。骨的愈合大約在術(shù)后3個月時可以完成，與其他大鼠骨折愈合相關(guān)實驗的愈合時間吻合[25-27]。我們沒有發(fā)現(xiàn)移植肢體的骨形態(tài)與對側(cè)正常側(cè)有明顯不同，也與移植前的狀態(tài)一致，表明沒有骨組織的吸收，沒有關(guān)節(jié)的脫位、骨折等。由于術(shù)后觀察時間較短，加之沒有康復(fù)訓(xùn)練計劃，術(shù)后3個月時移植側(cè)肢體沒有恢復(fù)正常的活動功能，但是感覺功能的恢復(fù)比較全面，速度也與以往報道的大鼠自體神經(jīng)損傷后的再生長速度一致[28]。

本研究與以往報道的大鼠后肢模型相比，需要更長的手術(shù)時間，骨固定和血管吻合對顯微外科技術(shù)的要求較高；移植物中用于組織學(xué)或其他實驗分析的組織量較后肢模型少。

4 結(jié)論

同種異體前臂移植的大鼠模型是可行的，可較好地模擬臨床前臂移植模型，為相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。