9種中藥單體的體外抗單梗著色霉活性評價(jià)

賀莉雅, 黃凱凱, 謝婷, 莫冬冬, 范瑞強(qiáng), 席麗艷, 魯莎, 陳信生

1.廣東省中醫(yī)院皮膚科,廣東 廣州 510120;2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院皮膚科,廣東 廣州 510120;3.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院,廣東 廣州 510091

著色芽生菌病(Chromoblastomycosis, CBM)是由致病性暗色真菌侵犯皮膚和皮下組織引起的慢性進(jìn)行性肉芽腫性真菌病[1]。該病常見于戶外工作者，與皮膚外傷有密切關(guān)系，好發(fā)部位為四肢，特別是小腿和足部。著色芽生菌病在世界各地均有報(bào)道，以熱帶、亞熱帶地區(qū)多見，近年發(fā)病率呈上升趨勢[2]。我國以廣東、山東和河南為高發(fā)區(qū)，但不同地區(qū)病原菌有所不同，北方以卡氏枝孢霉為主，南方則主要為著色霉屬，其中以單梗著色霉 (Fonsecaeamonophora)最為常見[3]。著色芽生菌病的治療目前仍為臨床難題，需要長期系統(tǒng)應(yīng)用抗真菌藥物或聯(lián)合用藥，面臨著治愈率低、復(fù)發(fā)率高、治療時(shí)間長及系統(tǒng)性抗真菌藥物不良反應(yīng)等困境[4]。目前暫無中藥治療著色芽生菌病的相關(guān)報(bào)道，本文參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(clinical and laboratory standards institute, CLSI) 制定的M38-A2方案中的微量基稀釋法，檢測9種中藥單體對單梗著色霉的體外抗真菌作用，旨在篩選出對單梗著色霉具有抑制作用的中藥單體, 為臨床應(yīng)用中藥治療著色芽生菌病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

單梗著色霉標(biāo)準(zhǔn)株CBS 296.37、質(zhì)控株近平滑念株菌ATCC 22019均由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)真菌研究中心提供。10株經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法鑒定為單梗著色霉的臨床分離株來自中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院皮膚科。

1.2 培養(yǎng)基

RPMI-1640液體培養(yǎng)基:用直徑為 0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):于115 ℃高壓滅菌20 min,置于室溫放涼備用。

1.3 藥物

蛇床子素、姜黃素、白鮮堿、知母皂苷、黃芩苷、苦參堿、丹皮酚、斑蝥素和大黃酚中藥單體購自上海麥克林生化科技有限公司，伊曲康唑購自美國sigma公司，均配制成10.24 mg/mL的母液作為儲(chǔ)存液。

1.4 菌懸液的配制

將保存的菌株接種到PDA培養(yǎng)基，35 ℃復(fù)蘇7 d,再轉(zhuǎn)種于PDA培養(yǎng)基，35 ℃活化10 d，用RPMI-1640液體培養(yǎng)基沖洗菌落表面收集分生孢子，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用RPMI-1640液體培養(yǎng)基調(diào)整孢子濃度至1×106CFU/mL，再稀釋50倍，得到終濃度為2×104CFU/mL的孢子懸液。

1.5 藥物敏感試驗(yàn)

采用微量液基稀釋法，參照CLSI制定的M38-A2標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。用RPMI-1640液體培養(yǎng)基調(diào)整各中藥單體的起始藥物濃度為1 024 μg/mL，在無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板第2～10孔中，連續(xù)倍比稀釋，第11孔為不含藥物的生長對照孔，第12孔為不含藥物且不含孢子的無菌對照孔。將制備的孢子懸液滴加到第1～11孔，于35 ℃孵育5 d。實(shí)驗(yàn)終止后，肉眼觀察判斷終點(diǎn)，加樣孔與生長對照孔比較，100%生長被抑制所對應(yīng)的濃度為此藥的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)[5]。伊曲康唑作為陽性對照，首孔藥物濃度為16 μg/mL。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 最低殺菌濃度 (minimum fungicidal concentration, MFC)測定

藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板取出，從高于各藥對應(yīng)MIC孔濃度(MIC值需≤1 024 μg/mL)的各孔中吸取20 μL的液體，均勻涂抹在PDA平板上，同時(shí)從生長對照孔取20 μL接種于 PDA 平板上，置于35 ℃孵育，到生長對照孔的轉(zhuǎn)種培養(yǎng)開始生長時(shí)為止，計(jì)數(shù)平板上的菌落。菌落完全不生長或者生長不足3個(gè)的最低藥物濃度即為最低殺菌濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 質(zhì)控

以近平滑念珠菌ATCC 22019為質(zhì)控菌，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，結(jié)果一致，表明結(jié)果可靠。

2 結(jié)果

2.1 微量稀釋法檢測不同中藥單體對11株單梗著色霉的MIC值

9種中藥單體MIC50為16～256 μg/mL，幾何均數(shù)(geometrical mean, GM)范圍為14.11～272.65 μg/mL(表1)。抑菌作用較強(qiáng)的中藥單體為蛇床子素、姜黃素和白鮮堿， MIC GM分別為14.11、28.21、52.98 μg/mL。知母皂苷、黃芩苷、苦參堿、丹皮酚、斑蝥素和大黃酚對單梗著色霉也具有一定的抑菌活性， MIC GM范圍為145.19～272.65 μg/mL。陽性對照伊曲康唑?qū)?1株單梗著色霉的MIC為0.031～0.125 μg/mL。

2.2 中藥單體對11株單梗著色霉的MFC值分布

9種中藥單體對11株單梗著色霉的MFC值均為128～>1 024 μg/mL(表2)。大部分中藥單體的 MFC值>1 024 μg/mL。蛇床子素MFC值為128～1 024 μg/mL，GM為272.65 μg/mL。陽性對照藥伊曲康唑MFC值為 0.25～2 μg/mL。

表1 9種中藥單體對11株單梗著色霉的MICs (株)Table 1 MICs of 9 Chinese herbal monomers against 11 strains of Fonsecaea monophora (Strain)

表2 9種中藥單體對11株單梗著色霉的MFCs (株)Table 2 MFCs of 9 Chinese herbal monomers against 11 strains of Fonsecaea monophora (Strain)

3 討論

目前用于治療著色芽生菌病的藥物非常有限，主要治療藥物為伊曲康唑和特比萘芬，它們存在不同程度的毒副作用，很多患者不能耐受且易復(fù)發(fā)[6]。研發(fā)或?qū)ふ矣行?、低毒和價(jià)廉的抗真菌藥物迫在眉睫。中藥資源廣泛，歷史悠久。篩選具有抗真菌作用的中藥單體，提取有效的活性成分，具有廣闊的前景和深遠(yuǎn)的意義。

很多中藥單體已被證實(shí)具有殺菌作用。如蛇床子素對酵母相馬爾尼菲籃狀菌的MIC為16～64 mg/L，對氟康唑天然耐藥株的MIC為32 mg/L[7]。蛇床子和知母的提取物均對大豆尖孢鐮刀菌有抑制作用[8]。姜黃素通過影響申克孢子絲菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)從而產(chǎn)生殺菌作用，并通過了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證[9]。白鮮堿與氟康唑?qū)Π咨钪榫哂袇f(xié)同作用[10]。黃芩苷通過破壞真菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的完整性, 阻礙細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換, 降低白色念珠菌線粒體SDH酶的活力, 影響氧化磷酸化過程, 損傷白色念珠菌線粒體, 降低營養(yǎng)物質(zhì)的吸收, 不可逆地抑制核酸、蛋白質(zhì)、脂類及糖的合成, 使白色念珠菌S/G2/M期細(xì)胞數(shù)下降而發(fā)揮藥理作用從而抑制白色念珠菌生長[11]。苦參堿1.0～4.0 μg/mL能使白色念珠菌細(xì)胞膜中的麥角固醇含量和CYP450酶活性下降,并有明顯的劑量依賴性,說明苦參堿可通過抑制白色念珠菌細(xì)胞膜的CYP51酶活性,影響麥角固醇生物合成而發(fā)揮其抗真菌活性[12]。大蒜素、小檗堿、苦參堿、蛇床子素和丹皮酚對球形孢子絲菌具有一定的抑菌活性，不同中藥單體抑菌活性存在差異[10]。

目前中藥對真菌的抑制及其作用機(jī)制研究主要集中在酵母菌[14]和皮膚癬菌[15]方面，對著色霉屬的研究較少。單梗著色霉是近年才被鑒定的新種[16]，目前國內(nèi)外暫無文獻(xiàn)報(bào)道中藥單體對單梗著色霉具有抑制作用。結(jié)合既往中藥單體抗真菌作用的文獻(xiàn)報(bào)道及中藥復(fù)方治療皮膚真菌感染的臨床研究結(jié)果[17]，本研究選取蛇床子素、姜黃素、白鮮堿、知母皂苷、黃芩苷、苦參堿、丹皮酚、斑蝥素和大黃酚9種中藥單體作為研究對象，MIC值結(jié)果與MFC值結(jié)果一致，表明該9種中藥單體對單梗著色霉具有一定的抑菌活性，其中蛇床子素、姜黃素和白鮮堿具有治療著色芽生菌病的潛力，但與臨床常用的抗真菌藥物如伊曲康唑的抗菌活性仍有一定差異。說明單獨(dú)使用中藥治療真菌性皮膚病具有一定局限性。

目前研究發(fā)現(xiàn)中藥單體對真菌抑制的作用機(jī)制主要包括中藥單體成分對真菌細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜影響[18]。由此推測，中藥單體抑制單梗著色霉的可能機(jī)制為通過抑制(1，3)-β-D-葡聚糖合成酶的活性或者通過麥角固醇絡(luò)合作用影響細(xì)胞膜的滲透性，從而導(dǎo)致氧化損傷以及致命的DNA損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。接下來的研究可進(jìn)一步探討中藥單體聯(lián)合抗真菌藥物的效果，并評價(jià)局部用藥的可行性，從而豐富著色芽生菌病的治療手段。