宮頸癌化療近期療效差異與DNA聚合酶ζ亞基REV3基因多態(tài)性的關(guān)系

楊 然 張清偉 馮 磊 董莉麗 李 松

宮頸癌患病率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤前3位，全球每年宮頸癌新發(fā)病例超50萬，死亡病例超26萬。化療是局部晚期宮頸癌治療的主要手段，對(duì)控制腫瘤進(jìn)展、預(yù)防宮頸癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有積極作用。但仍有較大一部分宮頸癌患者對(duì)化療不敏感，影響其預(yù)后。近年來，越來越多證據(jù)顯示，DNA損傷修復(fù)基因通過多途徑影響化療藥物敏感性。DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)涉及直接修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)等，其中跨損傷DNA合成通路(translesion DNA synthesis，TLS)基因在嚴(yán)重創(chuàng)傷修復(fù)中的作用越來越得到重視，已證實(shí)與含鉑類藥物化療耐藥及放療抵抗有密切關(guān)聯(lián)。DNA損傷修復(fù)為DNA自身修復(fù)的主要方式，修復(fù)過程由Y家族及B家族多種聚合酶參與，主要包括Y家族REV1，B家族DNA聚合酶ζ(polymerase ζ，Polζ)，屬旁路修復(fù)，過程包括DNA聚合酶轉(zhuǎn)換、堿基摻入及聚合酶延伸、解離。其中Pol ζ為TLS修復(fù)過程關(guān)鍵參與者，含REV3L蛋白及REV7L蛋白亞基，前者為催化亞基，與REV7L蛋白結(jié)合后結(jié)構(gòu)重排，產(chǎn)生與REV1蛋白結(jié)合位點(diǎn)，介導(dǎo)DNA損傷部位堿基轉(zhuǎn)換，與REV蛋白相互作用，募集Pol ζ至DNA損傷部位，產(chǎn)生延伸作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，敲除REV3基因后，癌細(xì)胞對(duì)順鉑藥敏增加。食管癌細(xì)胞試驗(yàn)中也得到相同結(jié)果。推測上述跨損傷DNA合成途徑對(duì)化療藥物敏感性產(chǎn)生影響。但對(duì)宮頸癌化療效果與Polζ亞基REV3基因多態(tài)性的關(guān)系尚未闡明。本研究對(duì)Polζ亞基REV3基因多態(tài)性與宮頸癌近期療效的關(guān)系展開研究，以期為宮頸癌治療提供分子學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2019年12月河南省南陽市中心醫(yī)院收治的宮頸癌患者96例(宮頸癌組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡>20歲；經(jīng)病理確診為宮頸鱗癌，國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期Ⅱ～Ⅳa期；既往未接受手術(shù)或抗腫瘤治療；無近期妊娠史；無其他部位腫瘤病史；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性宮頸癌；生殖系統(tǒng)畸形；自身免疫功能缺陷；惡液質(zhì)；心肝腎肺器質(zhì)性功能障礙；嚴(yán)重貧血(血紅蛋白濃度為30～60 g/L)；嚴(yán)重腦血管病如腦血管破裂、腦出血或急性腦梗死等；治療過程中出現(xiàn)無法耐受毒副反應(yīng)退出者；資料不全。宮頸癌組患者年齡22～68歲，平均(49.51±7.98)歲；按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期：Ⅱ期35例，Ⅲ期50例，Ⅳa期11例；病理分化程度：高分化31例，中分化46例，低分化19例。并選擇同期體檢的50例正常健康女性作為對(duì)照組，家族無宮頸癌病史，體健，年齡20～67歲，平均(48.97±8.41)歲。兩組研究對(duì)象性別、年齡等基線情況均衡可比(

P

>0.05)。

1.2 治療方法 所有宮頸癌組患者均接受順鉑+紫杉醇化療方案，第1天，紫杉醇(華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20084439)135～175 mg/m，3 h滴注完畢；第2天，順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20010743)50～70 mg/m，靜脈化療。每3周重復(fù)，共化療4個(gè)周期后評(píng)估療效。

1.3 Polζ亞基REV3基因多態(tài)性檢測方法 結(jié)合既往報(bào)道及國際人類基因組單體型圖計(jì)劃(Haplotypemap，即HapMap計(jì)劃)所公布漢族人群數(shù)據(jù)庫中篩選Polζ亞基REV3單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)定條件：最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>0.1，連續(xù)不平衡參數(shù)

r

>0.8，篩選rs181294、rs240966、rs465646共3個(gè)基因位點(diǎn)，DNA序列上美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)GenBank查詢并確定。宮頸癌組于化療前采集外周靜脈血5 mL，對(duì)照組于體檢當(dāng)日采集，枸櫞酸鈉抗凝管保存，提取外周血白細(xì)胞全基因組DNA[DNA抽提試劑盒(QIAamp DNA Mini Mix Kit Qiaen)購自德國Qiagen公司]，濃度及純度滿意后，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)法進(jìn)行基因擴(kuò)增，Taqman MGB探針對(duì)篩選Polζ亞基REV3 rs181294、rs240966、rs465646 3個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行分型(散點(diǎn)圖、擴(kuò)增曲線雙驗(yàn)證)，并采用美國ABI公司1377型測序儀進(jìn)行DNA直接測序驗(yàn)證基因分型的準(zhǔn)確性。

1.4 近期療效評(píng)估 宮頸癌組于化療結(jié)束1周內(nèi)評(píng)估治療療效，參照實(shí)體瘤療效標(biāo)準(zhǔn)。完全緩解：所有目標(biāo)可測病灶總和縮小至正常范圍，可測病灶完全消失；部分緩解：所有可測病灶徑線總和(目標(biāo)結(jié)節(jié)測定用短徑，其他目標(biāo)病灶使用長徑)較基線縮小30%以上；穩(wěn)定：可測病灶徑線總和縮小不超過30%或增大不超過20%；進(jìn)展：可測病灶徑線總和較基線增加20%，或有新病灶出現(xiàn)。以完全緩解和部分緩解視為化療敏感，作為敏感組；穩(wěn)定或進(jìn)展視為化療不敏感，作為非敏感組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 24.0軟件。Polζ亞基REV3位點(diǎn)基因型分布采用Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗(yàn)確定樣本群體代表性；Polζ亞基REV3基因型及等位基因分布采用例或率表示，組間對(duì)比用

χ

檢驗(yàn)；非條件logistic回歸模型計(jì)算相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)比值比(odds ratio，OR)及95%可信區(qū)間(95% confidence interval，95%CI)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象Polζ亞基REV3基因Hard-Weinberg遺傳平衡性檢驗(yàn) Hard-Weinberg遺傳平衡性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，宮頸癌組與對(duì)照組Polζ亞基REV3基因rs181294、rs240966、rs465646位點(diǎn)基因型分布與預(yù)計(jì)值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)，滿足Hard-Weinberg遺傳平衡性要求，具有群體代表性。見表1。

表1 宮頸癌組與對(duì)照組Polζ亞基REV3基因Hard-Weinberg遺傳平衡性檢驗(yàn)[例(%)]

2.2 兩組研究對(duì)象Polζ亞基REV3基因型分布比較 宮頸癌組、對(duì)照組Polζ亞基REV3 rs240966位點(diǎn)基因型分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)，rs181294、rs465646位點(diǎn)基因型分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，宮頸癌組rs181294位點(diǎn)G/A型、A/A型頻率高于對(duì)照組，rs465646位點(diǎn)A/G、G/G基因型頻率高于對(duì)照組(

P

<0.05)。見表2。

表2 宮頸癌與對(duì)照組Polζ亞基REV3基因型分布比較[例(%)]

2.3 宮頸癌易感性與Polζ亞基REV3基因型分布的關(guān)系 攜帶Polζ亞基REV3 rs240966 位點(diǎn)不同基因型分布頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。以G/G型為參照，攜帶REV3 rs181294位點(diǎn)A/A基因型可增加宮頸癌易感風(fēng)險(xiǎn)2.713倍；以A/A型為參照，攜帶rs465646位點(diǎn)A/G、G/G基因型增加宮頸癌易感風(fēng)險(xiǎn)4.015、3.571倍(

P

<0.05)。見表3。

表3 宮頸癌易感性與Polζ亞基REV3基因型分布的關(guān)系[例(%)]

2.4 宮頸癌易感性與Polζ亞基REV3等位基因分布的關(guān)系 攜帶Polζ亞基REV3 rs240966 位點(diǎn)不同等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。以G等位基因?yàn)閰⒄?，攜帶REV3 rs181294位點(diǎn)A型等位基因可增加宮頸癌易感風(fēng)險(xiǎn)1.765倍(

χ

=8.543，

P

<0.05)；以A等位基因?yàn)閰⒄?，攜帶rs465646位點(diǎn)G等位基因增加宮頸癌易感風(fēng)險(xiǎn)2.536倍(

χ

=11.411，

P

<0.05)。見表4。

表4 宮頸癌易感性與Polζ亞基REV3等位基因分布的關(guān)系[例(%)]

2.5 宮頸癌化療近期效果與Polζ亞基REV3基因型分布的關(guān)系 近期化療效果，96例宮頸癌患者完全緩解8例(8.33%)、部分緩解41例(42.71%)、穩(wěn)定40例(41.67%)、進(jìn)展7例(7.29%)，分為敏感組(

n

=49)與非敏感組(

n

=47)。敏感組與非敏感組rs240966位點(diǎn)基因型分布比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)；以G/G為參考，攜帶rs181294位點(diǎn)G/A基因型、A/A基因型可增加化療不敏感風(fēng)險(xiǎn)2.776、5.591倍(

χ

=22.856、19.600，

P

均<0.05)；以A/A為參照，攜帶rs465646位點(diǎn)A/G、G/G基因型可增加宮頸癌化療不敏感風(fēng)險(xiǎn)2.419、4.369倍(

χ

=5.229、4.721，

P

均<0.05)。見表5。

表5 宮頸癌化療近期效果與Polζ亞基REV3基因型分布的關(guān)系[例(%)]

2.6 宮頸癌化療近期效果與Polζ亞基REV3等位基因頻率分布的關(guān)系 敏感組與非敏感組攜帶Polζ亞基REV3 rs240966位點(diǎn)基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。以G等位基因?yàn)閰⒄眨瑪y帶REV3 rs181294位點(diǎn)A型等位基因可增加化療不敏感風(fēng)險(xiǎn)2.551倍(

χ

=25.975，

P

<0.05)；以A等位基因?yàn)閰⒄眨瑪y帶rs465646位點(diǎn)G等位基因增加化療不敏感風(fēng)險(xiǎn)1.714倍(

χ

=4.623，

P

<0.05)。見表6。

表6 宮頸癌化療近期效果與Polζ亞基REV3等位基因頻率分布的關(guān)系[例(%)]

3 討論

DNA聚合酶是參與機(jī)體跨損傷DNA合成通路復(fù)制后修復(fù)過程的重要酶類，可通過適應(yīng)模板DNA損傷，依據(jù)損傷結(jié)構(gòu)及不同聚合酶偏好引入堿基或造成突變。與基因組穩(wěn)定性及DNA突變均有關(guān)聯(lián)。Polζ是近年來研究較多，與TLS通路功能有關(guān)的DNA聚合酶，可通過聚合酶轉(zhuǎn)換，降低損傷部位低保真度DNA聚合酶復(fù)制延伸，保持基因組穩(wěn)定性，但不可避免誘導(dǎo)DNA突變?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤組織中Polζ亞基REV3基因表達(dá)高于正常組織，且大部分存在錯(cuò)配修復(fù)缺陷，推測Polζ亞基REV3與腫瘤發(fā)生有關(guān)。近期也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，REV3基因多態(tài)性與卵巢癌、乳腺癌易感性有關(guān)。但對(duì)Polζ亞基REV3對(duì)宮頸癌化療敏感性的影響尚未明確。

鉑類尤其順鉑系宮頸癌化療一線基礎(chǔ)藥物，通過DNA雙鏈鏈內(nèi)及鏈間交聯(lián)捕獲癌細(xì)胞周期，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，但癌細(xì)胞鉑類藥物耐藥導(dǎo)致其推廣受限。癌細(xì)胞對(duì)DNA損傷修復(fù)能力直接影響化療敏感性，癌細(xì)胞突變率上升是導(dǎo)致癌細(xì)胞化療耐藥的主要原因。TLS通路作為修復(fù)DNA損傷關(guān)鍵通路可能為參與癌細(xì)胞耐藥的重要機(jī)制。前期研究發(fā)現(xiàn)，REV3基因影響結(jié)腸癌、肺癌等多種癌細(xì)胞株克隆合成，敲除REV3基因可減緩細(xì)胞G1/S期增殖速度，減少細(xì)胞克隆形成，而過表達(dá)則可促進(jìn)克隆形成。Jiang等表示，肺癌模型REV3 rs465646位點(diǎn)基因突變與順鉑耐藥有關(guān)。本研究結(jié)合以往文獻(xiàn)報(bào)道及數(shù)據(jù)庫篩查結(jié)果選擇Polζ亞基REV3 3個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性與宮頸癌化療效果關(guān)系進(jìn)行探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攜帶rs181294、rs465646位點(diǎn)基因突變與宮頸癌易感性及宮頸癌化療不敏感有關(guān)，與王瑛等報(bào)道REV3在卵巢癌中作用的結(jié)論相似，說明Polζ亞基REV3基因部分位點(diǎn)基因遺傳變異可能與卵巢癌發(fā)病及治療效果有關(guān)，推測跨損傷DNA合成通路在宮頸癌細(xì)胞鉑類化療耐藥中存在特異性，攜帶Polζ亞基REV3 rs181294位點(diǎn)G/A基因型+A/A基因型及等位基因A均可能增加宮頸癌易感性，降低化療敏感度；攜帶rs465646位點(diǎn)A/G+G/G基因型及等位基因G人群宮頸癌易感性更高，有更低的化療敏感性。進(jìn)一步推測該位點(diǎn)基因突變可影響TLS通路DNA修復(fù)能力，在修復(fù)鉑類化療方案所致DNA交聯(lián)時(shí)，攜帶rs181294位點(diǎn)G/A+A/A基因型、A等位基因及攜帶rs465646位點(diǎn)A/G+G/G基因型及等位基因G宮頸癌患者Polζ亞基REV3可通過誘導(dǎo)多種堿基替換途徑引起癌細(xì)胞自發(fā)突變，增加宮頸癌易感性及癌細(xì)胞化療藥物耐藥，影響近期療效。此外，REV3上述位點(diǎn)基因突變可能影響DNA修復(fù)損傷過程堿基序列，導(dǎo)致REV3基因莖環(huán)結(jié)構(gòu)改變，降低其轉(zhuǎn)錄效率，影響化療敏感性。

綜上，Polζ亞基REV3 rs181294、rs465646位點(diǎn)基因多態(tài)性與宮頸癌易感性及鉑類化療近期療效有關(guān)，攜帶rs181294位點(diǎn)G/A+A/A基因型、A等位基因及攜帶rs465646位點(diǎn)A/G+G/G基因型及等位基因G患者有更高的宮頸癌易感風(fēng)險(xiǎn)及鉑類化療藥物不敏感風(fēng)險(xiǎn)，可作為宮頸癌易感人群篩查及化療敏感性篩查的依據(jù)。但馬曉璐表示，人REV3基因受環(huán)境因素影響較大，可對(duì)環(huán)境因子產(chǎn)生應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)造成細(xì)胞突變。但本研究尚未分析環(huán)境因素對(duì)Polζ亞基REV3突變的影響，后續(xù)需進(jìn)一步擴(kuò)充樣本量，探究REV3基因突變對(duì)宮頸癌易感性及化療效果影響的確切機(jī)制。