熒光定量PCR法與免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃黏膜中幽門螺桿菌感染的臨床意義

王曉楠（天津市東麗區(qū)東麗醫(yī)院,天津 300300）

幽門螺桿菌（HP）屬于革蘭陰性螺旋桿菌，主要定植于胃黏膜上皮細(xì)胞表面，其感染與消化性潰瘍、胃癌等發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。免疫組織化學(xué)法（IHC）可在組織切片技術(shù)的基礎(chǔ)上特異性結(jié)合抗體、抗原并通過(guò)組織化學(xué)顯色技術(shù)原理實(shí)施檢測(cè)，具有高敏感度和特異度，易于判斷陽(yáng)性，是診斷HP感染的常用手段[3]。熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（FQ-PCR）法具有敏感度高、特異度高等特點(diǎn)，還能定量分析病原體核酸，逐漸被應(yīng)用于微生物感染[4]。本研究分析FQ-PCR法與IHC檢測(cè)胃黏膜中HP感染的臨床意義，為臨床診斷方式選擇提供參考。詳情報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年8月-2020年12月我院接診的86例慢性胃炎患者，均采集胃黏膜活檢標(biāo)本，其中女48例，男38例；年齡26-81歲，平均年齡（56.85±3.45）歲。

1.2 試劑與儀器 徠卡全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀（LeicaBONDMAX型）；全自動(dòng)熒光定量PCR儀（ABI7500型）；HP免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒（Dako公司）；購(gòu)自北京新基永康生物科技有限公司的HP23SrRNA基因突變核酸檢測(cè)與HP分型鑒定試劑盒；購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的HP鑒定試劑盒；購(gòu)自北京厚生博泰科技有限公司的DNA提取試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 IHC檢測(cè)HP 切取每例患者胃黏膜切片，厚度為4μm，設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照，使用全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀染色。陽(yáng)性判讀標(biāo)準(zhǔn)：鏡下胃黏膜黏液層、腺管上皮、小凹上皮、上皮表面存在著色為棕黃色的HP菌體。觀察鏡下胃黏膜黏液層、腺管上皮、小凹上皮、上皮表面HP判斷感染強(qiáng)度。無(wú)：未見HP；輕度感染（+）：低于標(biāo)本全長(zhǎng)1/3或偶見有少數(shù)HP；中度感染（++）：HP分布超過(guò)標(biāo)本全長(zhǎng)1/3而低于2/3，或連續(xù)性、薄而稀疏地存在于上皮表面；重度感染（+++）：HP基本分布于標(biāo)本全長(zhǎng)，成堆存在。

1.3.2 FQ-PCR檢測(cè)HP 切取每例患者石蠟組織切片10張，厚度為10μm，置入潔凈的EP管內(nèi)，用毛筆刷干凈后，實(shí)施DNA提取。石蠟組織樣本內(nèi)加入緩沖液GA250μL，90℃環(huán)境下孵育60min，離心后，取200μL包含組織的液體，加入至新的EP管內(nèi)，滴加蛋白酶K40μL，顛倒混勻，水浴，溫度為56℃，過(guò)夜消化，待組織完全消化為準(zhǔn)。離心處理消化后的液體，吸上清，加入新的EP管內(nèi)，加入250μL緩沖液GB，震蕩混勻后，水浴10min，溫度為70℃。加入250μL無(wú)水乙醇，震蕩混勻、離心。在DNA吸附柱內(nèi)加入獲取的混合液，放置1min，離心，將濾液去除。加入緩沖液GD500μL，放置1min，離心，將濾液去除。加入500μLPW，放置1min，離心，將濾液去除，重復(fù)兩次。在新的收集管內(nèi)套入吸附柱，離心后開蓋，靜置2min，使乙醇揮發(fā)。加入70℃預(yù)熱后的Elution緩沖液50μL，靜置2min，需Elution緩沖液在硅基質(zhì)膜的中間懸空滴加，以確保洗脫液能完全覆蓋硅基質(zhì)膜。離心后獲取樣本DNA提取液。以每份TaqDNA聚合酶0.25μL、反應(yīng)液22.5μL的標(biāo)準(zhǔn)分別配制分型、鑒定反應(yīng)混合液，震蕩混勻后，離心，按每管樣本2.5μL、反應(yīng)混合液22.5μL分裝至PCR反應(yīng)管中。最后加入陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照，離心，實(shí)施PCR擴(kuò)增。調(diào)整閾值線，計(jì)算閾值（Ct值）。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書計(jì)算樣本的ΔCt值，判讀感染強(qiáng)度。輕度感染（+）：ΔCt值＞3.00；中度感染（++）：ΔCt值為0.01-3.00；重度感染（+++）：ΔCt值為0.00-0.01。

1.3.3 23SrRNA基因突變核酸檢測(cè) 對(duì)IHC與FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果不一致樣本實(shí)施HP23SrRNA基因突變核酸檢測(cè)。前期操作與FQPCR檢測(cè)相同，調(diào)整閾值線，計(jì)算Ct值。陽(yáng)性感染：HP23S反應(yīng)液1和2中存在VIC或FAM通道（23SrRNA反應(yīng)液1中FAM通道、VIC通道分別為A2142G、AA野生型；反應(yīng)液2中FAM通道、VIC通道分別為A2143G、AA野生型）且Ct值≤35.00。

1.4 觀察指標(biāo) ①分析IHC與FQ-PCR檢測(cè)胃黏膜標(biāo)本中HP感染情況及其感染強(qiáng)度。②分析FQ-PCR檢測(cè)胃黏膜標(biāo)本中HP分型檢測(cè)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本次實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)，用（±s）表示計(jì)量資料，組間比較用t檢驗(yàn)；以n（%）表示計(jì)數(shù)資料，組間比較用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料使用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HP感染情況 86份標(biāo)本經(jīng)FQ-PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為30.23%（26/86），IHC檢測(cè)陽(yáng)性率為25.58%（22/86），兩者檢測(cè)HP陰性符合率為93.75%（60/64），陽(yáng)性符合率為84.62%（22/26），總符合率為95.35%（82/86）。兩種檢查方式對(duì)HP陽(yáng)性檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.462，P=0.497）。兩種檢查方式中共有4例不一致樣本，均為FQ-PCR檢測(cè)出而IHC未檢出HP感染，對(duì)其實(shí)施HP23SrRNA基因突變核酸檢測(cè)，結(jié)果顯示均為陽(yáng)性，可見存在HP感染。

2.2 HP感染強(qiáng)度 IHC與FQ-PCR檢測(cè)胃黏膜標(biāo)本中HP感染強(qiáng)度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 HC與FQ-PCR檢測(cè)胃黏膜標(biāo)本中HP感染強(qiáng)度比較[n(%)]

2.3 HP分型檢測(cè)結(jié)果 FQ-PCR檢測(cè)胃黏膜標(biāo)本中HP陽(yáng)性標(biāo)本26例，其中Ⅱ型菌4例（15.38%）。

3 討論

HP感染后產(chǎn)生多種致病因子，對(duì)胃黏膜形成損害，誘發(fā)噯氣、反酸等癥狀，是引發(fā)胃腺癌、慢性胃炎等胃腸疾病發(fā)病的相關(guān)細(xì)菌感染[5]。HE染色、糞便HP抗原檢測(cè)、尿素呼氣試驗(yàn)等均是檢測(cè)HP的常用手段，其中常規(guī)HE染色檢測(cè)具有價(jià)廉、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但菌體有著色差異，可能會(huì)發(fā)生染色較淺和無(wú)法與其他污染物或雜菌區(qū)分情況[6]。尿素呼氣試驗(yàn)無(wú)創(chuàng)、操作簡(jiǎn)便，但需口服放射性同位素，可能會(huì)影響環(huán)境、人體，且不適用于胃輕癱、胃下垂、幽門梗阻、晚期胃癌、高位梗阻、十二指腸瘀滯癥等患者[7-8]。糞便HP抗原檢測(cè)操作簡(jiǎn)便、無(wú)需口服任何試劑且無(wú)任何不良反應(yīng)，為完全非侵入性檢查，且無(wú)需昂貴儀器，但檢查結(jié)果會(huì)受到試劑貯藏條件、運(yùn)輸和操作方法、操作人員技術(shù)等因素影響[9]。IHC檢測(cè)準(zhǔn)確性較高，但檢測(cè)依賴于病理醫(yī)師鏡下觀察經(jīng)驗(yàn)與判讀經(jīng)驗(yàn)，檢查結(jié)果會(huì)受到人為主觀因素影響，且無(wú)法對(duì)HP做出分型判斷。

本研究中，兩種檢查方式對(duì)HP陽(yáng)性檢出率、檢測(cè)胃黏膜標(biāo)本中HP感染強(qiáng)度均無(wú)明顯差異；共有4例不一致樣本，均為FQPCR檢測(cè)出而IHC未檢出的HP感染，對(duì)其實(shí)施HP23SrRNA基因突變核酸檢測(cè)，結(jié)果顯示均為陽(yáng)性；FQ-PCR檢測(cè)胃黏膜標(biāo)本中HP陽(yáng)性標(biāo)本26例，其中Ⅱ型菌4例，提示IHC與FQ-PCR檢測(cè)HP感染具有較高的符合率。FQ-PCR檢測(cè)可靶向標(biāo)記23SrRNA基因與16SrRNA基因，實(shí)行完全閉管式操作，避免擴(kuò)增產(chǎn)物受到污染。FQ-PCR檢測(cè)還能適時(shí)定量擴(kuò)增產(chǎn)物，使反應(yīng)精確度提高，結(jié)果可靠、操作簡(jiǎn)便，且能自動(dòng)讀數(shù)，進(jìn)而避免發(fā)生人為誤差[10]。FQ-PCR檢測(cè)還具有取材方便、標(biāo)本易于保存、檢查耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，適用于HP感染大規(guī)模篩查。

綜上所述，IHC與FQ-PCR檢測(cè)HP感染情況與感染強(qiáng)度符合率較高，F(xiàn)Q-PCR法還能檢測(cè)HP基因分型，可將其作為在檢測(cè)胃黏膜中HP時(shí)IHC法的替代檢測(cè)法。