貴州省兩個(gè)藍(lán)莓品種組培苗和扦插苗干旱脅迫響應(yīng)

周 熒，王 頔，聶 飛*

（1.貴州省生物研究所，貴州貴陽(yáng) 550009；2.湄潭縣林業(yè)局，貴州遵義 564100）

藍(lán)莓為叢生灌木，生產(chǎn)上一般采用組培和扦插2 種繁殖方式。藍(lán)莓為淺根系植株，無(wú)主根，根系纖細(xì)無(wú)根毛［1］。藍(lán)莓喜酸性疏松土壤，因此選擇抗旱性強(qiáng)的品種對(duì)藍(lán)莓苗木在不同生態(tài)區(qū)適應(yīng)性極其重要。

貴州藍(lán)莓種植地多為山地，喀斯特地貌，小氣候類(lèi)型多，主要土壤類(lèi)型為黃壤、紅壤、黃棕壤、棕壤、石灰土和水稻土這幾大類(lèi)，土壤保水能力差，土壤暫時(shí)性干旱頻繁發(fā)生［2-3］。干旱脅迫是植物常見(jiàn)的逆境脅迫之一，不僅制約植物的生長(zhǎng)發(fā)育，并且對(duì)植物的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響［4］。植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)過(guò)程和受脅迫程度與植物自身的抗性相關(guān)，植物會(huì)從表型、生理功能、分子結(jié)構(gòu)、生化代謝、形態(tài)適應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育、生物量及產(chǎn)量等多種形式表現(xiàn)［5-7］。因此，從植物生理學(xué)及形態(tài)特征出發(fā)，是開(kāi)展干旱脅迫下植物生理生化反應(yīng)及葉片解剖結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)研究的重要方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)材料為貴州瑞藍(lán)果業(yè)有限公司麻江縣種苗繁育基地“萊克西”和“燦爛”2 個(gè)藍(lán)莓品種的移栽后1.5年生組培和扦插容器苗?！盃N爛”組培苗用CLZ 表示，“燦爛”扦插苗用CLQ 表示，“萊克西”組培苗用LKXZ 表示，“萊克西”扦插苗用LKXQ 表示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 干旱脅迫

2017 年8 月，選擇生長(zhǎng)健壯、枝葉均勻移栽后1.5年生幼苗進(jìn)行水分脅迫處理，脅迫方式為土壤干旱漸進(jìn)脅迫。每個(gè)藍(lán)莓品種各選擇長(zhǎng)勢(shì)較一致的移栽幼苗25 株進(jìn)行脅迫處理。先對(duì)試驗(yàn)容器苗進(jìn)行充分澆水3 d 后停止?jié)菜蛊溥M(jìn)行自然干旱，分別于停止?jié)菜蟮? d、第14 d、第21 d、第28 d 隨機(jī)選取植株功能葉片，測(cè)定葉片相對(duì)含水量、葉片相對(duì)電導(dǎo)率、葉綠素含量、丙二醛（MDA）含量、脯氨酸（Pro）含量，每次采樣時(shí)對(duì)土壤進(jìn)行含水量的測(cè)定，每個(gè)指標(biāo)測(cè)定3 次重復(fù)。

1.2.2 葉片切片制作

在脅迫第7 d 和第28 d 分別選取“燦爛”“萊克西”2個(gè)藍(lán)莓品種組培和扦插的1.5 年生苗作為試驗(yàn)材料，分別將采集的大小一致無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的葉片跨中脈截取0.5 cm×0.5 cm 作為材料，用FAA 固定液固定24 h以上，梯度酒精和二甲苯進(jìn)行脫水和透明，進(jìn)行常規(guī)石蠟切片制作，切片厚度8～10 μm，番紅-固綠染色，樹(shù)脂膠封片，Nikon eclipse-e200 顯微鏡下觀察、隨機(jī)選取30 個(gè)視野進(jìn)行拍照測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1）土壤含水量。采用土壤烘干法測(cè)定土壤含水量。

2）葉片相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定。參考陳文榮等的改進(jìn)方法采用佑科DDS-307A 型電導(dǎo)率儀測(cè)定［8］，將待測(cè)葉片擦洗干凈，每個(gè)樣品稱取0.1 g 放入用20 mL 去離子水，用注射器抽真空，搖床振蕩3 h，靜置1 h，測(cè)定初電導(dǎo)率及所用去離子水的電導(dǎo)空白，沸水浴15 min 殺死組織細(xì)胞，靜置1 h，測(cè)終電導(dǎo)率。相對(duì)電導(dǎo)率的計(jì)算公式為（1）：

3）葉片相對(duì)含水量。取鮮葉稱鮮葉質(zhì)量，在蒸餾水中用注射器抽取真空，浸泡24 h 后稱其飽和鮮樣質(zhì)量，之后在100～105 ℃下烘干，稱其干樣質(zhì)量。相對(duì)含水量的計(jì)算公式為（2）：

4）葉綠素、丙二醛（MDA）及游離脯氨酸（Pro）含量。葉綠素含量采用丙酮乙醇1 ∶1 浸泡提取比色，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法，游離脯氨酸（Pro）采用酸性茚三酮法［9］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013 進(jìn)行錄入，采用spss 18.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理，多重比較分析，單因素方差分析、隸屬函數(shù)平均值法綜合評(píng)價(jià)苗木抗旱性。

隸屬函數(shù)平均值法中，若為正相關(guān)，則：

若為負(fù)相關(guān)，則：

式中：i表示某個(gè)品種；j表示某項(xiàng)指標(biāo)；Uij表示i種類(lèi)j指標(biāo)的抗旱隸屬函數(shù)值；Xij表示i種類(lèi)j指標(biāo)的測(cè)定值；Xjmin表示所有種類(lèi)j指標(biāo)的最小值；Xjmax表示所有種類(lèi)j指標(biāo)的最大值。

權(quán)重應(yīng)用客觀賦權(quán)法進(jìn)行計(jì)算：

其中Ij是一個(gè)無(wú)量綱數(shù)，表示某評(píng)價(jià)指標(biāo)在干旱脅迫下的測(cè)定值相對(duì)于對(duì)照組的比值。Cj是第j個(gè)指標(biāo)正常組的測(cè)定值。Sj是第j個(gè)指標(biāo)在某個(gè)脅迫處理下所測(cè)定的平均值。

如果是負(fù)相關(guān)，則計(jì)算式為Ij=Sj/Cj。最后通過(guò)歸一化，計(jì)算出每個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重：Wj=Ij/∑Ij。綜合評(píng)價(jià)值：D=∑(Uij×Wj)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下土壤含水量的變化

不同干旱處理時(shí)間土壤含水量變化如圖1 所示。由圖1 可知（小寫(xiě)字母代表顯著性p＜0.05，下同），不同脅迫時(shí)間土壤相對(duì)含水量差異顯著（p＜0.05）；處理第7 d，土壤含水量均值為84.72%±1.14%（正常生長(zhǎng)），第28 d 的土壤含水量均值為24.78%±0.85%（重度干旱）。隨著干旱脅迫的天數(shù)增加，土壤含水量下降顯著，從第7 d 到第14 d 時(shí)下降最明顯，整體下降33.30%。

圖1 不同干旱處理時(shí)間土壤含水量變化

2.2 干旱脅迫下藍(lán)莓葉片葉綠素含量的變化

不同干旱時(shí)間葉綠素含量變化如圖2 所示。由圖2可知，隨著干旱脅迫增加，葉綠素含量逐漸降低?！叭R克西”藍(lán)莓在第14 d 葉綠素含量下降明顯，扦插苗和組培苗比第7 d 分別下降了32.52%、51.14%；“萊克西”藍(lán)莓組培苗從第14 d 后變幅很小，“萊克西”藍(lán)莓扦插苗在干旱脅迫期間變幅最大，第28 d 葉綠素含量最小為（1.16±0.02）mg·g-1，比第7 d 下降了67.48%。“燦爛”藍(lán)莓在第21 d 明顯下降；“燦爛”藍(lán)莓組培苗在后期變化緩慢，“燦爛”藍(lán)莓扦插苗整體變化較明顯。

圖2 不同干旱時(shí)間葉綠素含量變化

2.3 干旱脅迫下藍(lán)莓葉片丙二醛含量的變化

不同干旱時(shí)間葉片丙二醛（MDA）含量變化如圖3所示，隨著干旱程度的增加，丙二醛含量呈增加趨勢(shì)。干旱前期，“萊克西”藍(lán)莓和“燦爛”藍(lán)莓中MDA 含量差異顯著（p＜0.05），“萊克西”藍(lán)莓中MDA 含量變幅較小，組培苗和扦插苗中MDA 含量的變幅分別僅為3.56%、7.78%；干旱后期，“燦爛”藍(lán)莓中MDA 含量的變幅明顯弱于“萊克西”藍(lán)莓，組培苗和扦插苗的變幅分別為11.32%、5.43%。在干旱脅迫時(shí)MDA 含量相差最大的是“燦爛”藍(lán)莓組培苗，為58.54 nmol·g-1，其次是“燦爛”藍(lán)莓扦插苗，變化為44.89 nmol·g-1，“萊克西”藍(lán)莓的扦插苗和組培苗變化差距不大，分別為42.07 nmol·g-1、42.88 nmol·g-1。

圖3 不同干旱時(shí)間葉片MDA 含量變化

2.4 干旱脅迫下脯氨酸含量變化

不同干旱時(shí)間葉片脯氨酸含量變化如圖4 所示。由圖4 可知，隨著干旱脅迫的增加，葉片脯氨酸含量逐漸增加，但增加幅度不一致。4 種類(lèi)型的藍(lán)莓苗初始和結(jié)束時(shí)的脯氨酸含量差異明顯（p＜0.05），初始時(shí)脯氨酸含量“萊克西”藍(lán)莓扦插苗最大，其次是“燦爛”藍(lán)莓扦插苗，脅迫第28 d 時(shí)脯氨酸含量從大到小依次是“萊克西”藍(lán)莓扦插苗、“萊克西”藍(lán)莓組培苗、“燦爛”藍(lán)莓扦插苗、“燦爛”藍(lán)莓組培苗，且4 種幼苗脯氨酸差異顯著（p＜0.05）?！叭R克西”藍(lán)莓扦插苗在第7 d 時(shí)含量最小，但是在第14 d 后脯氨酸含量均大于其他3 種幼苗，且第28 d 的含量是第7 d 的1.86 倍，說(shuō)明“萊克西”藍(lán)莓扦插苗對(duì)干旱脅迫反應(yīng)強(qiáng)烈。

圖4 不同干旱時(shí)間葉片脯氨酸含量變化

2.5 干旱脅迫下葉片相對(duì)含水量變化

不同干旱時(shí)間葉片相對(duì)含水量變化如圖5 所示，隨著水分脅迫程度的加強(qiáng)，藍(lán)莓葉片的相對(duì)含水量逐漸降低。脅迫初期葉片相對(duì)含水量最大的是“萊克西”藍(lán)莓組培苗，含量為82.80%，最小的是“燦爛”藍(lán)莓組培苗，含量為70.18%。脅迫第21 d 以前葉片相對(duì)含水量4 種幼苗均變化幅度較小，第28 d 時(shí)變化幅度較大，變化幅度最大的是“萊克西”藍(lán)莓扦插苗，最小的是“燦爛”藍(lán)莓扦插苗。

圖5 不同干旱時(shí)間葉片相對(duì)含水量變化

2.6 干旱脅迫下葉片相對(duì)電導(dǎo)率變化

干旱程度的加劇會(huì)造成植物的膜傷害，質(zhì)膜透性增大，電導(dǎo)率值即可反映傷害程度，從而鑒定出植物的抗旱能力。隨著干旱時(shí)間的增加葉片相對(duì)電導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)，如圖6 所示。脅迫初期，“燦爛”藍(lán)莓扦插苗和組培苗變幅明顯，第14 d 葉片相對(duì)電導(dǎo)率分別比第7 d 上升了1.97 倍和1.31 倍；在脅迫后期，“萊克西”藍(lán)莓扦插苗和組培苗相對(duì)電導(dǎo)率變化較明顯，第28 d 比第21 d上升了61%和87%。可見(jiàn)，4 種藍(lán)莓幼苗在不同脅迫時(shí)間受脅迫程度不一樣。

圖6 不同干旱時(shí)間葉片相對(duì)電導(dǎo)率變化

2.7 干旱脅迫下藍(lán)莓抗旱性評(píng)價(jià)

隸屬函數(shù)法是目前應(yīng)用最廣的多指標(biāo)評(píng)價(jià)方法［10-11］，通過(guò)對(duì)4 種苗木各項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)，由表1 可知，抗旱性由強(qiáng)到弱的是“燦爛”藍(lán)莓組培苗、“萊克西”藍(lán)莓組培苗、“萊克西”藍(lán)莓扦插苗、“燦爛”藍(lán)莓扦插苗。

表1 兩種繁殖方式下兩個(gè)品種抗旱性綜合評(píng)價(jià)

2.8 干旱脅迫下藍(lán)莓葉片結(jié)構(gòu)變化

對(duì)干旱脅迫下藍(lán)莓葉片進(jìn)行石蠟切片比較，結(jié)果表明，“燦爛”藍(lán)莓和“萊克西”藍(lán)莓的組培苗的上表皮厚度值、柵欄組織厚度值、葉片厚度值、柵海比值均高于扦插苗，見(jiàn)表2。

表2 葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)

3 結(jié)論與討論

隨著干旱程度加深，不同繁殖方式下4 種藍(lán)莓幼苗葉綠素含量、葉片相對(duì)含水量不斷下降，丙二醛含量、脯氨酸含量、葉片相對(duì)電導(dǎo)率不斷增加。在干旱脅迫下，幼苗在生理上首先表現(xiàn)為葉片水分虧缺；在生化方面水分脅迫導(dǎo)致活性氧等自由基積累，引起膜脂過(guò)氧化，膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 含量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸含量增加，幼苗迅速啟動(dòng)保護(hù)酶系統(tǒng)和積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)；在結(jié)構(gòu)上由于水分虧缺引起細(xì)胞脫水，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，質(zhì)膜相對(duì)透性增加［12-14］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，4 種苗木在干旱脅迫下，土壤含水量降低，導(dǎo)致植株根系吸水困難，植株組織水分虧缺，葉片相對(duì)含水量降低，“萊克西”藍(lán)莓扦插苗葉片相對(duì)含水量降低最明顯，“燦爛”藍(lán)莓組培苗的葉片相對(duì)含水量變化最小，葉片相對(duì)含水量變化小，說(shuō)明“燦爛”藍(lán)莓組培苗在干旱脅迫下能通過(guò)維持組織含水量來(lái)抵御干旱。此外，葉綠素含量是植物對(duì)干旱脅迫響應(yīng)敏感的指標(biāo)，大量的研究結(jié)果表明，干旱脅迫通過(guò)抑制葉綠素合成，并加速其分解，導(dǎo)致葉綠素含量直線下降［12,15］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，干旱脅迫下葉綠素均顯著下降，但在脅迫后期，“燦爛”藍(lán)莓和“萊克西”藍(lán)莓的組培苗均變化不明顯，這種變化可能是植株在受到脅迫后引起膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生MDA 和脯氨酸阻礙了葉綠素的合成。

植物器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)與植物生理功能密切相關(guān)，生理變化間接導(dǎo)致形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，表皮是葉片結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，植物解剖結(jié)構(gòu)中表皮越厚，其抗旱、隔熱、持水能力一般均較強(qiáng)，對(duì)于干旱逆境的抵抗力越強(qiáng)［16-17］。本試驗(yàn)中“燦爛”藍(lán)莓和“萊克西”藍(lán)莓兩種苗木，均是扦插苗的上表皮厚度大于組培苗葉小而厚，柵欄組織發(fā)達(dá)，柵欄組織與海綿組織比值高，角質(zhì)層及上皮層厚，葉肉細(xì)胞小而排列緊密，氣孔下陷、表皮毛發(fā)達(dá)等都是抗旱性強(qiáng)的標(biāo)志［18-21］。本試驗(yàn)中，從葉片厚度來(lái)看，“燦爛”藍(lán)莓葉片厚度明顯厚于“萊克西”藍(lán)莓，一般認(rèn)為葉片小而厚是植物抗旱的特征，細(xì)小的葉形可以減少水分蒸發(fā)的面積，葉片越厚，儲(chǔ)水能力越強(qiáng)［22］。隸屬函數(shù)的抗旱性綜合評(píng)價(jià)得出的結(jié)果與此一致，但在植物抗旱性綜合評(píng)價(jià)中不能用單一的指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，因?yàn)橹参锏目购敌耘c植物本身的結(jié)構(gòu)和外界環(huán)境有關(guān)，單一的指標(biāo)評(píng)定很難反應(yīng)客觀結(jié)果，可采用多種指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)［19］。