豬苓菌核共生營養(yǎng)優(yōu)勢蜜環(huán)菌初步篩選

韋中強(qiáng)，肖 波，李 娜，韓 量，秦 靜

（重慶市藥物種植研究所/重慶市中藥良種選育與評(píng)價(jià)工程技術(shù)中心，重慶 408435）

豬苓（Polyporus umbellatus）別名野豬苓、豬屎苓、雞屎苓、猴豬屎、地烏桃，屬膽子菌亞門層菌綱非裕菌目多孔菌科多孔菌屬。豬苓為傳統(tǒng)常用名貴中藥材，在我國已有2 000 多年的用藥歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為中品，其“味甘，治痞瘧，解毒，蠱注不祥，利水道，久服輕身不老?！逼渚司哂欣疂B濕作用［1］。自古以來我國一些民間和中醫(yī)就有豬苓治療癥癜積聚和腫瘤等癥。近年來，隨著抗癌藥的熱銷及豬苓為原料的中成藥開發(fā)，市場需求急劇增長，豬苓供需矛盾日趨尖銳，野生豬苓資源遭到過度采挖，已日益枯竭［2］，已被我國列為“三級(jí)保護(hù)野生中藥材”。同時(shí)，使得豬苓的生產(chǎn)方式向人工種植發(fā)展，家種豬苓與野生豬苓的化學(xué)成分無明顯的差異［3］，在栽培過程中，蜜環(huán)菌是豬苓菌核生長關(guān)鍵必備的伴生菌［4-5］，因此對(duì)豬苓菌核生長發(fā)育優(yōu)勢蜜環(huán)菌作了初步篩選，以期篩選出豬苓菌核親和力強(qiáng)的優(yōu)勢蜜環(huán)菌菌株，應(yīng)用于生產(chǎn)，為提高豬苓產(chǎn)業(yè)的技術(shù)水平和規(guī)模發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

供試蜜環(huán)菌菌株引自國內(nèi)豬苓和天麻主產(chǎn)區(qū)，菌株及來源見表1；蜜環(huán)菌菌株A9，由陜西省西鄉(xiāng)縣食用菌研究所提供；豬苓菌株選用生長性能表現(xiàn)較好的Pu-1，由陜西省西鄉(xiāng)縣食用菌研究所提供；豬苓菌核形成伴生菌，由重慶市藥物種植研究所藥用菌研究中心提供。

表1 蜜環(huán)菌菌株及來源

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA（Potato Dextrse Agar）培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，自來水1 000 mL，pH 自然。

麥麩培養(yǎng)基配方：麥麩93.00%，葡萄糖2.00%，KH2PO40.30%，MgSO4·7H2O 0.15%，瓊脂1.00%。

1.1.3 栽培樹棒

準(zhǔn)備直徑6 cm 粗、30 cm 長的栓皮櫟樹棒，用于豬苓栽培，截取樹枝培養(yǎng)Gu-7（藥植1 號(hào)）蜜環(huán)菌菌株備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同來源蜜環(huán)菌菌株生長速率考察

于25 ℃條件下，將7 個(gè)蜜環(huán)菌菌株母種分別轉(zhuǎn)接到PDA 培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)活化；分別轉(zhuǎn)接 PDA 平板培養(yǎng)備用，將培養(yǎng)好的7 個(gè)供試菌株分別用孔徑為0.6 cm 打孔器邊緣取樣，置于新的PDA 平板培養(yǎng)基中心，蓋上培養(yǎng)皿蓋25 ℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲萌動(dòng)后，每隔24 h 測量1 次菌落直徑（取3 個(gè)方向的平均值），直到菌絲長滿整個(gè)平板為止，計(jì)算出蜜環(huán)菌在PDA 平板培養(yǎng)基上的平均生長速度。每個(gè)菌株3 次重復(fù)。

1.2.2 不同蜜環(huán)菌菌株液體發(fā)酵菌絲體生長干重

將液體PDA培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，常規(guī)滅菌，在滅菌后的三角瓶培養(yǎng)基中分別接入0.5 cm2的蜜環(huán)菌菌塊，在25 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)。培養(yǎng)20 d 后，分別將菌絲取出，并用蒸餾水沖洗菌絲體數(shù)次，洗掉菌絲體上的培養(yǎng)液，然后置于60 ℃烘箱中烘至恒重，再稱其干重。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置重復(fù)3 次。

1.2.3 蜜環(huán)菌發(fā)酵液對(duì)豬苓菌絲生長影響

將蜜環(huán)菌菌株Gu-7、A9 分別接種于PDA 液體培養(yǎng)基中，25 ℃、120 r·min-1暗培養(yǎng)14 d 提取發(fā)酵液，按發(fā)酵液10 mL/皿分別制PDA 平板，分別接種豬苓Pu-1 菌絲進(jìn)行培養(yǎng)，以不含發(fā)酵液PDA 平板培養(yǎng)為對(duì)照。菌絲萌動(dòng)后每日同一時(shí)間測量菌落直徑，每次測3 個(gè)方向取平均值，做好記錄直至滿皿。

1.2.4 豬苓菌核誘導(dǎo)試驗(yàn)

樹棒栽培豬苓，將準(zhǔn)備好的樹棒每隔5～8 cm 砍1個(gè)魚鱗口；準(zhǔn)備少量并間隔3 cm 沿縱向截取0.5～1.0 cm厚表皮的樹棒。取豬苓菌種和豬苓菌核伴生菌分別接于650 mL 棕色廣口瓶中的麥麩培養(yǎng)基上，置于（23±2）℃條件下避光培養(yǎng)，培養(yǎng)好備用，取出已培養(yǎng)感染藥植1號(hào)蜜環(huán)菌菌株的細(xì)樹枝。按如下方法誘導(dǎo)栽培。

誘導(dǎo)方法1：在花盆的底部平鋪3～4 cm 厚的粗砂，上放已感染蜜環(huán)菌菌索的細(xì)樹枝（見圖1），用粗沙覆蓋，厚度8 cm；其上放樹棒，將長滿廣口瓶的豬苓菌種和豬苓菌絲形成菌核伴生菌分別取出，間隔接種于的魚鱗口內(nèi)；樹棒的兩側(cè)各放置1～2 個(gè)豬苓菌核作引子。之后用粗砂覆蓋，厚度為5 cm。

誘導(dǎo)方法2：方法1 中改放樹棒，間隔接豬苓菌種和伴生菌于去掉表皮樹棒的縱截面上，之后蓋上其樹皮。其余相同。

誘導(dǎo)方法3：方法1 中改放樹棒，接豬苓菌種于樹棒兩端的截面處；接伴生菌于棒中間所砍魚鱗口內(nèi)。其余相同。

誘導(dǎo)方法4：方法1 中放已感染蜜環(huán)菌菌索的細(xì)樹枝后，改粗砂覆蓋厚度1 cm。其余相同。

誘導(dǎo)方法5：方法1 中不放蜜環(huán)菌菌枝；其余相同。

誘導(dǎo)方法6：方法1 中不放豬苓菌核作引子；其余相同。

誘導(dǎo)方法7：方法1 中不接伴生菌；其余相同，本方法為對(duì)照。

對(duì)照和每1 誘導(dǎo)方法（處理）分別重復(fù)5 次。澆水保持濕度，（23±2）℃條件下培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源蜜環(huán)菌菌株生長速率

菌絲體的生長，在營養(yǎng)供應(yīng)等條件適宜的情況下沒有明顯的波動(dòng)，大體上呈勻速生長。培養(yǎng)3 d 后開始出現(xiàn)菌索，平板培養(yǎng)的第5 d，菌落直徑約為培養(yǎng)皿直徑的2/3，按照此時(shí)的菌落直徑計(jì)算菌絲日平均生長速度，見表2。

表2 不同蜜環(huán)菌菌株菌絲生長速率

根據(jù)結(jié)果，不同蜜環(huán)菌菌株菌絲的日平均生長速度從大到小的順序?yàn)镚u-7 ＞Gu-5 ＞Gu-3 ＞Gu-6 ＞Gu-1 ＞Gu-2 ＞Gu-4，說明Gu-7，Gu-5，Gu-3 菌株的生長性能較為優(yōu)勢。

2.2 不同蜜環(huán)菌菌株液體發(fā)酵菌絲體生長干重

經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，不同來源蜜環(huán)菌菌株菌絲體干重統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

表3 不同蜜環(huán)菌菌株菌絲干重

試驗(yàn)結(jié)果表明：7 株蜜環(huán)菌菌株液體培養(yǎng)菌絲體干重以Gu-7 最高（4.76 mg/10 mL）,其次是Gu-5（4.25 mg/10 mL），最低為Gu-4（2.24 mg/10 mL），說明Gu-7、Gu-5、Gu-3 菌株的液體發(fā)酵生長性能較佳。

2.3 蜜環(huán)菌發(fā)酵液對(duì)豬苓菌絲生長的影響

不同來源蜜環(huán)菌發(fā)酵液對(duì)豬苓菌絲生長的影響觀察，觀察到兩株蜜環(huán)菌發(fā)酵液處理的豬苓菌絲生長情況均較穩(wěn)定（見圖1），并且這兩種蜜環(huán)菌發(fā)酵液處理的豬苓菌絲生長情況均好于對(duì)照（CK），并測定豬苓菌絲生長速率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。

圖1 培養(yǎng)的蜜環(huán)菌樹枝菌種

表4 固體培養(yǎng)的豬苓菌絲平均生長速率

試驗(yàn)結(jié)果表明，供試兩株蜜環(huán)菌發(fā)酵液處理的豬苓菌絲平均生長速率都高于CK，并且A9、藥植1 號(hào)發(fā)酵液對(duì)豬苓菌絲生長起到促進(jìn)作用，A9 處理的豬苓菌絲平均生長速率與藥植1 號(hào)，差異不明顯，與對(duì)照相比達(dá)顯著水平。

2.4 豬苓菌核誘導(dǎo)試驗(yàn)

樹棒栽培誘導(dǎo)豬苓菌核播種后120 d，試驗(yàn)觀察結(jié)果見表5。從表中不同誘導(dǎo)方法對(duì)豬苓菌絲形成菌核影響可以看出，誘導(dǎo)方法1、誘導(dǎo)方法2、誘導(dǎo)方法5、誘導(dǎo)方法6 豬苓菌株和伴生菌均生長良好，菌核形成較快，數(shù)量較多，見圖2。誘導(dǎo)方法3 形成的菌核較少，誘導(dǎo)方法4和7 無菌核形成。豬苓生產(chǎn)菌核形成是關(guān)鍵，豬苓菌核后續(xù)生長需要共生蜜環(huán)菌提供營養(yǎng)，觀察到蜜環(huán)菌感染了豬苓菌核，菌索侵入了菌核，見圖3，為豬苓生長提供營養(yǎng)。

圖2 誘導(dǎo)形成豬苓菌核

表5 不同栽培方法對(duì)豬苓菌絲形成菌核的影響

圖3 蜜環(huán)菌侵染豬苓菌核生長情況

樹棒誘導(dǎo)栽培，從栽培角度綜合考慮，誘導(dǎo)方法6優(yōu)于其他誘導(dǎo)方法，該方法有利于提供大量的菌核，適用于大面積生產(chǎn)，當(dāng)豬苓菌核形成后蜜環(huán)菌侵入菌核，持續(xù)提供豬苓菌核繼續(xù)生長發(fā)育的營養(yǎng)。

3 結(jié)論與討論

豬苓生產(chǎn)中，豬苓菌核形成后，后續(xù)生長必需依靠共生蜜環(huán)菌提供營養(yǎng)，支撐其發(fā)育繁殖形成豬苓商品，所以優(yōu)良的蜜環(huán)菌菌株對(duì)豬苓生產(chǎn)尤其重要。本試驗(yàn)結(jié)果表明，蜜環(huán)菌Gu-7 菌株日生長速率6.130 mm·d-1和菌絲體干重4.76 mg/10 mL）是7 株供試菌株中較為突出，表現(xiàn)出生長性能優(yōu)勢的菌株。蜜環(huán)菌對(duì)豬苓菌核是從灰苓階段起侵入的，在樹棒栽培中也觀察到蜜環(huán)菌菌索侵染灰苓，菌核前段白苓沒有菌索侵染，說明中間豬苓與蜜環(huán)菌存在一定的識(shí)別機(jī)制，這與已報(bào)道的研究類似。蜜環(huán)菌Gu-7、A9 發(fā)酵液對(duì)豬苓菌絲生長有明顯的促進(jìn)作用，根據(jù)王秋穎等人的研究結(jié)果也得到了印證［6］。傳統(tǒng)豬苓栽培一般采用小菌核作種源，由于豬苓菌核生長緩慢、生產(chǎn)周期較長（一般3～5 年）、繁殖率低、投種量較大，很難提供大量豬苓小菌核用于人工栽培，苓種匱乏，是制約人工栽培豬苓產(chǎn)量、質(zhì)量及效益的主要因素；運(yùn)用大量生產(chǎn)的蜜環(huán)菌Gu-7 菌株，并通過本試驗(yàn)7 種豬苓菌核誘導(dǎo)栽培模式探討，誘導(dǎo)方法1、誘導(dǎo)方法2、誘導(dǎo)方法5 和誘導(dǎo)方法6 能較快培育大量種苓，有利于豬苓大面積推廣栽培。栽培方法6 優(yōu)勢明顯，在優(yōu)質(zhì)蜜環(huán)菌共生條件下，有利于豬苓菌核生長形成商品。但有待進(jìn)一步探討蜜環(huán)菌對(duì)豬苓商品產(chǎn)量、質(zhì)量形成的影響。