冬瓜均一化酵母雙雜交cDNA文庫的構建及鑒定

陳 鳳，閆晉強，李梅蘭，江 彪

（1.山西農業(yè)大學園藝學院，山西 晉中 030801；2.廣東省農業(yè)科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】冬 瓜（Benincɑsɑ hispidɑCogn.）是我國重要的蔬菜作物，對調節(jié)蔬菜淡季、保證周年供應有著重要作用［1］。酵母雙雜交技術是研究蛋白質互作的重要分子生物學技術，也是研究生物大分子互作和調控的重要方法。構建高質量cDNA文庫是運用酵母雙雜交技術的前提，其中均一化cDNA文庫可增加克隆低豐度mRNA的機會，克服基因轉錄水平的巨大差距給文庫篩選和分析帶來的障礙［2］。此外，構建冬瓜酵母雙雜交cDNA文庫為探究冬瓜基因功能奠定重要的材料基礎?！厩叭搜芯窟M展】構建均一化cDNA文庫對新基因發(fā)掘并研究其調節(jié)網絡具有重要作用，而運用SMART技術結合DSN均一化處理是構建均一化酵母文庫的常用方法。李真真等［3］利用該技術構建了大白菜pol型雄性不育花蕾均一化cDNA文庫。茄子SmEDS1正調控青枯病抗性［4］，肖熙鷗等［5］利用酵母雙雜交技術從相應的均一化cDNA酵母文庫中篩選到包括TCP轉錄因子在內的9個茄子SmEDS1互作蛋白，推測SmEDS1可能通過與TCP轉錄因子互作調控水楊酸的合成，進而調控茄子的青枯病抗性。酵母雙雜交技術是研究蛋白質分子間相互作用的有效手段［6］。構建高質量的酵母雙雜交cDNA文庫是深入研究基因功能、高效率高質量進行酵母雜交實驗的基礎［7］。在白菜［3］、甜瓜［8］、草莓［9］、黃瓜［10］、番茄［11］等蔬菜作物中已構建了cDNA文庫。張文慧［10］通過構建黃瓜頂芽cDNA文庫，以CsWIP1構建雙雜交誘餌質粒，以CsPI的啟動子片段構建單雜交誘餌質粒，篩選與其有相互作用的成分，獲得有效基因和單克隆測序。王洋等［11］以番茄的根、葉、花及不同發(fā)育時期的果實為材料，構建酵母雙雜交文庫，并用于互作蛋白篩選?！颈狙芯壳腥朦c】冬瓜應用基礎研究起步相對較晚，但基因組測序及核心種質資源基因組重測序的完成顯著促進了冬瓜分子生物學的快速發(fā)展［12］，目前已對冬瓜果重、果實長度、果皮顏色等重要性狀進行了基因定位［1］。然而，冬瓜酵母雙雜交cDNA文庫的構建仍未見報道，一定程度上限制了依賴于酵母雙雜交技術的冬瓜基因功能研究。【擬解決的關鍵問題】本研究以冬瓜參考基因組測序所用材料B227的根、莖、葉、雄花和嫩果等不同組織為試驗材料，構建高質量的冬瓜酵母雙雜交cDNA文庫，以期為冬瓜蛋白質互作等試驗提供物質條件，為深入開展基因功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為冬瓜自交系B227（冬瓜參考基因組測序材料），由廣東省農業(yè)科學院蔬菜研究所提供，于2019年春季種植在廣東省農業(yè)科學院白云基地。在坐果期選取長勢良好植株的根、莖、葉、雄花、嫩果（開花后5 d）等組織，放置液氮中速凍后，于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩嶒炦^程中主要采用cDNACloneMinerTMⅡ cDNA Library Construction Kit（Invitrogen）文庫構建試劑盒進行文庫構建。PureLink?HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit、LRClonaseTMⅡ Enzyme Mix、ElectroMAXTMDH10BTMT1 Phage Resistant Cells購 自Life。cDNACloneMinerTMⅡ cDNA Library Construction Kit試劑盒、Platinum?Taq DNA Polymerase試劑盒、Gateway?BP Clonase?ⅡEnzyme Mix試劑盒、PureLink?HiPurePlasmid Filter Midiprep Kit試劑盒均購自Invitrogen公司。DSN酶試劑盒購自Evrogen公司。

1.2 RNA提取和mRNA分離

取適量不同組織樣品，利用CTAB法分別提取各組織總RNA并等量混合，隨后按照Invitrogen公司構建cDNA文庫操作說明書進行mRNA的分離和純化，用1%瓊脂糖凝膠電泳測定總RNA和mRNA的完整性，用NanoDrop 2000蛋白核酸定量測定儀測定其濃度和質量。

1.3 雙鏈cDNA合成

以分離得到的mRNA為模板，利用SuperScriptⅢ RT酶按照試劑盒SuperScriptTMPlasmid System with Gate-way Technology for cDNA Synthesis and Cloning說明書進行cDNA第一條鏈的合成；以反轉錄后的第一鏈cDNA為模板，與在Escherichiɑ coliDNA Ligase、E.coliDNA Polymerase I和E.coliRNase H及T4 DNA Polymerase 的作用下反應合成cDNA第二鏈，隨后與三框att B1 Adapter重組接頭連接。

1.4 cDNA均一化處理

按照DSN酶試劑盒（Evrogen）說明，進行帶接頭雙鏈cDNA的DSN均一化處理。以處理過的cDNA為模板，按照Platinum?Taq DNA Polymerase（Invitrogen）說明書進行2輪PCR擴增，PCR反應程序：95 ℃1 min，95 ℃15 s，66 ℃20 s，72 ℃3 min，20個循環(huán)。然后按照文庫構建試劑盒說明進行cDNA分級分離。

1.5 cDNA初級文庫構建

按 照Gateway?BP Clonase?Ⅱ Enzyme Mix說明，處理得到的cDNA和pDONR222載體的BP重組反應，重組產物通過電轉化方法轉化ElectroMAX DH10B細胞后，加2 mL S.O.C.培養(yǎng)基至電轉化杯中，將菌液吸至15 mL離心管中，在37 ℃搖床中225～250 r/min振蕩培養(yǎng)1 h后涂布LB平板，37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d計數。在平板中隨機挑取24個單克隆，以pDONR222F（5'-TCCCAGTCACGACGTTGTAAAA CGACG GCCAGTCTT-3'）和pDONR222R（5'-AG AGCTGCCAGGAAACAGCTATGACCATGTAATA CGAC TC-3'）為正、反向引物進行菌落PCR，PCR反應程序：94 ℃5 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2 min，35個循環(huán)，72 ℃5 min。按照“文庫庫容量（CFU）=平板上的克隆數/50 μL× 1 000倍×1×103μL×文庫菌液總體積（mL）”的方法，計算初級文庫庫容量和初級文庫重組率：

1.6 cDNA表達文庫構建

取初級文庫菌液接種至100 mL肉湯培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，30℃下250 r/min搖菌培養(yǎng)至OD600為1.0。使用PureLink?HiPurePlasmid Filter Midiprep Kit提取文庫質粒，并將pGADT7-DEST載體與初級文庫質?；旌线M行LR重組反應。重組產物電轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH10B后，添加2 mL S.O.C.培養(yǎng)基到電轉化杯中，將菌液吸至15 mL離心管中，置于37℃、225～250 r/min培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)結束后，取菌液1 μL按照1∶1 000稀釋，取50 μL涂布平板，37℃培養(yǎng)過夜，第2天計數。剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度為20%并存于-80℃，此為酵母文庫菌液。隨機挑取24個克隆進行菌落PCR鑒定，以ADR（5'-GTGA ACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3'）和T7（5'-TAATACGACTCACTATAGGGCGA GCGCCGCCATG-3'）為正、反向引物進行PCR反應，反應產物經1%瓊脂糖凝膠檢測。

2 結果與分析

2.1 總RNA 提取及mRNA分離

采用CTAB法提取冬瓜不同組織RNA，等量混合后進行RNA質量檢測。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示28S和18S條帶清晰，寬度和亮度約為2∶1，無拖尾現象，核糖體RNA條帶清晰且完整、穩(wěn)定性好（圖1A）?？俁NA經分離和純化后獲得mRNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA質量，結果（圖1B）顯示純化后的mRNA彌散性分布、長度分布均勻、條帶范圍分布廣，拖帶最亮部分大于500 bp。表明分離純化的mRNA質量良好，可作為建庫起始樣品。

圖1 總RNA 提?。ˋ）及mRNA分離（B）Fig.1 Total RNA extraction（A）and mRNA isolation（B）

2.2 均一化cDNA初級文庫的構建

由圖2可知，均一化處理后，與原來的cDNA相比，均一化的cDNA沒有較亮的特異條帶，片段呈均勻彌散分布，表明不同片段的轉錄產物拷貝數已是相似數量，實現了不同轉錄本拷貝數量的均一化。

以均一化的cDNA為模板構建初級文庫，經統(tǒng)計，平均每個平板菌落生長的克隆數為206個（圖3），計算出初級文庫庫容量為8.24×106CFU。隨機挑選文庫中24個單克隆進行菌落PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示均有擴增產物，初級文庫重組率為100%；擴增出的插入片段大小不一，插入片段平均長度大于850 bp，主要分布在850～3 000 bp，說明轉入了大小不等的片段（圖4）。以上結果表明，所構建的均一化cDNA初級文庫重組率較高、質量好，可用于后續(xù)次級文庫的構建。

圖4 初級文庫重組率檢測Fig.4 Detection of recombination rate of primary library

2.3 次級文庫的構建及質量鑒定

將pGADT7-DEST載體與初級文庫質粒稀釋后混合于LR重組反應體系，重組產物電轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH10B后，培養(yǎng)得到酵母文庫菌液。取菌液10 μL按照1∶1 000稀釋后，取50 μL涂布LB平板計數生長克隆用于庫容量鑒定。平均每個平板菌落生長的克隆數為258個（圖5），根據公式計算冬瓜酵母雙雜交cDNA文庫的庫容量為1.03×107CFU，足以克隆到低豐度表達的基因。隨機挑取24個克隆進行菌落PCR鑒定，用瓊脂糖凝膠電泳檢測插入cDNA片段的大小。由圖6可知，挑取的24個單菌落均有效擴增，表明得到的酵母文庫陽性重組率達100%；擴增出的插入片段大小集中在850～3 000 bp，條帶之間大小存在明顯差異，表明文庫多態(tài)性良好；擴增條帶基本上都大于1 000 bp，表明文庫中長片段所占比例較大，插入片段序列的完整性較好。綜上所述，本研究構建的酵母文庫完整性好、覆蓋度高，能反映來自冬瓜組織的遺傳信息，符合酵母雙雜交篩選要求，可用于后續(xù)互作蛋白篩選或蛋白與DNA互作等相關試驗。

圖5 酵母雙雜交 cDNA 文庫庫容量鑒定Fig.5 Identification of yeast two-hybrid cDNA library capacity

圖6 酵母雙雜交 cDNA 文庫重組率鑒定Fig.6 Identification of recombination rate of yeast two-hybrid cDNA library

3 討論

酵母雜交技術是進行基因功能研究的重要手段，構建高質量的酵母文庫是進行酵母雜交技術的基礎。為避免文庫中組織特異性表達基因的丟失，本研究以冬瓜參考基因組所用材料B227的根、莖、葉、雄花和嫩果等不同組織為材料，構建均一化酵母雙雜交cDNA文庫。高純度、完整性好的mRNA是構建文庫的關鍵，直接影響文庫質量［13］。本研究提取的冬瓜組織混合RNA樣本經瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清楚，無明顯降解，純度和完整性較高；分離純化后的mRNA呈彌散狀均勻分布，質量較高，符合建庫要求。cDNA文庫的質量可根據其代表性和重組序列的完整性進行評價［14-16］，且一個具備完整信息的cDNA文庫的庫容量至少應達到1×106CFU［17］。本研究構建的初級和次級cDNA文庫的庫容量分別為8.24×106CFU和1.03×107CFU，容量均達到建庫標準，說明本文庫覆蓋度完整，滿足了低豐度mRNA的篩選要求。文庫中的重組cDNA插入片段大小和基因的重組率代表重組序列的完整性［18-19］。植物cDNA長度在0.5～3.0 kb之間，文庫插入片段過小或過大均會對文庫質量造成一定影響［20］。本研究構建的初級和次級cDNA文庫基因重組率均是100%，且插入片段主要集中在850～3 000 bp，說明本文庫重組的cDNA序列遺傳信息完整性高，符合cDNA文庫的完整性好、高質量等要求。

cDNA文庫的普遍應用已取得一定成果，不僅可以用于目的基因克隆，而且還適用于基因功能研究?；ㄉ鶤hRRS5基因是花生響應青枯病菌侵染的正調控因子［21］，陳玉婷等［22］利用酵母雙雜交技術從青枯病菌誘導的花生根組織cDNA文庫中篩選到包括AhSBT1.6在內的互作蛋白，并通過雙分子熒光互補驗證了AhRRS5與AhSBT1.6體內互作關系，為研究AhRRS5基因提供花生青枯病菌抗性的分子機制奠定了重要基礎。通過酵母雙雜交技術，廖鈺秋等［23］從馬鈴薯cDNA文庫中篩選到若干StMAPKK1互作蛋白，為研究該基因參與植物生長發(fā)育等功能提供依據。

在冬瓜及其變種節(jié)瓜中，研究者進行了部分基因的克隆和表達分析。冬瓜BhMAPK15在高溫、低溫和干旱等非生物脅迫下表達量發(fā)生變化，表明該基因參與冬瓜非生物脅迫響應［24］。節(jié)瓜CqACS基因受GA3誘導表達，且在普通材料中雄花和雌花中的表達量顯著高于雌性系材料，表明CqACS可能與節(jié)瓜性型分化有關［25］。此外，本課題組及其他冬瓜研究團隊已經開展重要農藝性狀的基因定位，之后將會進行候選基因的挖掘和功能驗證。冬瓜cDNA文庫的缺乏在一定程度上限制了冬瓜基因功能的研究工作，因此，本研究所構建的冬瓜酵母雙雜交cDNA文庫具有重要意義，為后續(xù)開展相關基因功能研究奠定了基礎。

4 結論

本研究以冬瓜參考基因組測序材料B227的根、莖、葉、雄花、嫩果等不同組織為材料，經過RNA提取、mRNA分離、cDNA合成并進行DSN均一化處理后，以此為模板連接到pGADT7-DEST載體，成功構建了冬瓜均一化酵母雙雜交cDNA文庫。該cDNA文庫庫容量為1.03×107CFU，重組率為100%，插入片段主要集中在850～3 000 bp。文庫中長片段所占比例較大，插入片段序列的完整性較好，均一化處理提升了研究表達豐度較低蛋白的成功率。綜上所述，本研究所構建的酵母文庫完整性好、覆蓋度高，能反映來自冬瓜組織的遺傳信息，符合酵母雙雜交篩選要求，可用于后續(xù)依賴于酵母雙雜交技術的互作蛋白篩選或蛋白與DNA互作等相關試驗，為冬瓜基因功能研究、分子調控網絡解析的開展提供了條件。