草甘膦對(duì)小球藻生長(zhǎng)和氮磷去除的毒物興奮效應(yīng)*

周瓊芝， 鄭偉東， 賀 眾， 張 楠

(湘潭大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，湖南 湘潭 411105)

0 引言

近年來(lái)，隨著工農(nóng)業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；透咚侔l(fā)展，農(nóng)藥和農(nóng)用化肥(如氮肥、磷肥等)的施用量迅速增加，嚴(yán)重污染了人類(lèi)生活環(huán)境，我國(guó)約有1 600萬(wàn)公頃農(nóng)業(yè)土地受到污染[1-2]，國(guó)內(nèi)河流中已經(jīng)有70.6%被農(nóng)藥污染[3].同時(shí)，氮、磷等植物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)隨各種廢水進(jìn)入到江河、湖泊、海洋等自然水體中，造成嚴(yán)重的水體富營(yíng)養(yǎng)化，致使藻類(lèi)等水生植物大量繁殖[4]，從而導(dǎo)致水生態(tài)系統(tǒng)物種分布失衡.

草甘膦作為一種廣譜性有機(jī)磷除草劑，具有高效、低毒、低殘留、能提高農(nóng)作物產(chǎn)品質(zhì)量等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和日常生活中[5-6].但暴露在環(huán)境中的草甘膦可通過(guò)多種途徑進(jìn)入水體并造成水體污染，會(huì)對(duì)人體健康和水生生物產(chǎn)生潛在毒性[7].藻類(lèi)作為水生生態(tài)系統(tǒng)最主要的初級(jí)生產(chǎn)者，在維持水生生態(tài)系統(tǒng)平衡和穩(wěn)定方面十分重要[8].藻類(lèi)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥非常敏感，且具有生長(zhǎng)周期短、繁殖迅速的特點(diǎn)，因此可以成為一種良好的毒物風(fēng)險(xiǎn)測(cè)試生物.在某些特定條件下，藻類(lèi)會(huì)在短時(shí)間內(nèi)爆發(fā)性增殖或高度聚集，導(dǎo)致其他生物死亡，從而增加引發(fā)水華、赤潮的風(fēng)險(xiǎn)[9].在一定的范圍里低濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥可能會(huì)對(duì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)產(chǎn)生刺激興奮作用.低濃度下的樂(lè)果農(nóng)藥會(huì)增加小球藻的生物量、細(xì)胞內(nèi)的葉綠素和蛋白質(zhì)含量以及堿性磷酸酶活性，促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)[10].Belz[11]的研究表明除草劑能增強(qiáng)植物光合作用，從而提高植物對(duì)除草劑的適應(yīng)性，刺激植物的生長(zhǎng).

本論文以小球藻為受試生物，旨在探討有機(jī)磷農(nóng)藥草甘膦對(duì)小球藻生長(zhǎng)和氮磷去除的毒性興奮效應(yīng)，為草甘膦的合理安全使用提供理論依據(jù)，以更好地認(rèn)識(shí)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的整體效應(yīng).

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

普通小球藻(FACHB-1068)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫(kù).納氏試劑、酒石酸鉀鈉、鉬酸銨、抗壞血酸、小球藻OECD營(yíng)養(yǎng)鹽、草甘膦、二甲基亞砜、蒽銅、考馬斯亮藍(lán)、醋酸鈉、對(duì)硝基苯磷酸二鈉均為分析純.實(shí)驗(yàn)用水均為超純水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葉綠素含量的測(cè)定小球藻經(jīng)過(guò)草甘膦處理，取10 mL藻液離心(4 000 r/min,10 min)，棄上清液，加二甲基亞砜3.33 mL，65 ℃水浴20 h；然后離心，將上清液轉(zhuǎn)移到10 mL棕色瓶(避光防止色素分解)中，添加6.67 mL 80%丙酮到離心管中，混勻，離心，再將上清液轉(zhuǎn)移到10 mL棕色瓶中定容.取上清液用于可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光值(波長(zhǎng)645 nm和663 nm)[12]葉綠素a、b和葉綠素總含量的計(jì)算公式分別如下：

ρChla= 12.70A663- 2.69A645，

(1)

ρChlb= 22.9A645- 4.64A663，

(2)

ρChl= 20.2A645+ 8.02A663.

(3)

式中：ρChla和ρChlb分別為葉綠素a和b的濃度;ρChl為葉綠素總濃度;A645和A663分別為葉綠體色素提取液在波長(zhǎng)645 nm和663 nm下的吸光值.

1.2.2 蛋白質(zhì)和可溶性多糖的測(cè)定硫酸-蒽銅法：取0.5 mL的待測(cè)液放入試管中，加超純水0.5 mL，按順序向試管內(nèi)加入5 mL硫酸蒽銅試劑，振蕩搖勻，于沸水浴中反應(yīng)10 min，置冷水中冷卻.用分光光度計(jì)測(cè)量620 nm波長(zhǎng)下的吸光度.

考馬斯亮藍(lán)法：取1 mL的待測(cè)液放入試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，充分混合，放置2 min后于595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度.

1.2.3 氮磷吸收關(guān)鍵酶(GS、ACP)活性的測(cè)定采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定谷氨酰胺合成酶活性：提取液體積按5 000∶1～1 000∶1的比例取5 mL，超聲破碎細(xì)胞(冰浴，功率60%或600 W，超聲2 s，間隔3 s，持續(xù)10 min)；8 000 g在4 ℃條件下離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)；測(cè)定540 nm下的吸光值.

采用分光光度法測(cè)量酸性磷酸酶活性：取草甘膦處理后的樣品100 mL，4 000 r/min離心10 min，留下藻泥，加入0.2 mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH 5.8)8 mL超聲破碎，隨后12 000 r/min離心15 min，靜置.取上清液1 mL，加入0.05 mol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉(醋酸鈉緩沖液配置)2 mL，加蓋搖勻，37 ℃水浴30 min. 水浴后分別加入終止液CaCl22 mL濃度為0.5 mol/L和NaOH 2 mL 濃度為2 mol/L以終止反應(yīng)，搖勻.2 500 r/min離心5 min，4 000 r/min再離心5 min.取上清液測(cè)量410 nm處的吸光值[13].

1.2.4 超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的測(cè)定采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定：提取液體積按5 000∶1～1 000∶1的比例取5 mL，超聲破碎細(xì)胞(冰浴，功率60%或600 W，超聲2 s，間隔3 s，持續(xù)10 min)；8 000 g在4 ℃條件下離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)；SOD測(cè)定560 nm下的吸光值，CAT測(cè)定240 nm下的吸光值.

1.2.5 細(xì)胞膜通透性測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的非特異性酯酶能夠水解FDA，產(chǎn)生熒光，通過(guò)測(cè)定FDA的水解速率來(lái)反應(yīng)細(xì)胞膜的通透性[14].取藻液離心，用PBS洗滌兩遍，于分光光度計(jì)680 nm下調(diào)節(jié)吸光值為0.110 Abs(藻密度約為1.0×106cells/mL)[15].測(cè)定時(shí)加入FDA溶液，使其最終濃度為1.0×10-6mol/L.使用熒光分光光度計(jì)的時(shí)間模式掃描加入FDA后前10 min的水解速率(線(xiàn)性方程的斜率).激發(fā)波長(zhǎng)480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm，電壓700 V，狹縫寬度：5 nm.所測(cè)相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.98以上.為了更好地觀察草甘膦對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響，換算成相對(duì)細(xì)胞膜通透性.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 草甘膦對(duì)小球藻細(xì)胞生物量的影響

草甘膦對(duì)小球藻生物量的影響如圖1所示，當(dāng)草甘膦濃度分別為 0.25 mg/L和0.50 mg/L 時(shí)，小球藻生長(zhǎng)第7天的藻密度分別為10.44×106cells/mL和10.66×106cells/mL.與對(duì)照組相比，0.25 mg/L和0.50 mg/L的草甘膦濃度促進(jìn)了小球藻生長(zhǎng)，增長(zhǎng)率分別為0.28%和2.50%，而當(dāng)加入草甘膦的濃度為 1 mg/L、5 mg/L、15 mg/L、30 mg/L、45 mg/L時(shí)，小球藻生長(zhǎng)第7天的藻密度分別為10.03×106cells/mL、9.78×106cells/mL、9.27×106cells/mL、7.78×106cells/mL、4.36×106cells/mL，小球藻的生長(zhǎng)受到抑制，抑制率分別為3.56%、5.96%、10.87%、25.19%、58.08%.由以上結(jié)果分析可得，低濃度草甘膦能促進(jìn)藻類(lèi)生長(zhǎng).

圖1 草甘膦對(duì)小球藻生物量的影響Fig.1 The effect of glyphosate on the biomass of Chlorella vulgaris

沈宏等[16]研究表明，草甘膦對(duì)小球藻的毒害和藻類(lèi)降解草甘膦這兩個(gè)過(guò)程同時(shí)存在，在濃度較低時(shí)降解過(guò)程占主導(dǎo)地位，而降解產(chǎn)物可作為藻類(lèi)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)源，從而促進(jìn)藻細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成的增加，因此有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)表現(xiàn)為低濃度的刺激效應(yīng)和高濃度的抑制作用.

2.2 草甘膦對(duì)小球藻氮磷去除效率的影響

圖2 草甘膦對(duì)小球藻氨氮去除率的影響Fig.2 Removal efficiency of mg/L) by Chlorella vulgaris under glyphosate

圖3 草甘膦對(duì)小球藻正磷酸鹽去除率的影響Fig.3 Removal efficiency of PO43+ mg/L) by Chlorella vulgaris under glyphosate

2.3 草甘膦對(duì)小球藻葉綠素、可溶性多糖和蛋白質(zhì)的影響

表1所示為草甘膦在不同濃度下，小球藻在實(shí)驗(yàn)周期第7天的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量.從表1可以看出，葉綠素含量均隨著草甘膦濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在低濃度范圍內(nèi)(0～0.5 mg/L)提高了小球藻的葉綠素含量，且在0.5 mg/L時(shí)葉綠素含量出現(xiàn)最大值，其中葉綠素a含量為16.31 mg/L，葉綠素b含量為7.05 mg/L，總?cè)~綠素含量為22.90 mg/L，葉綠素a、b含量比值為2.31.以上結(jié)果表明：當(dāng)草甘膦濃度低于某一閾值時(shí)，能促進(jìn)藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素的合成；高濃度草甘膦(1～45 mg/L)，葉綠素含量均低于對(duì)照組，說(shuō)明高濃度草甘膦抑制了藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素的合成.研究報(bào)道，葉綠素含量的高低能反映細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，當(dāng)五氯苯酚的濃度低于0.99 μg/L時(shí)提高了小球藻和銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)葉綠素a的含量，由于藻細(xì)胞自身通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡抵消了低濃度的五氯苯酚對(duì)藻細(xì)胞的毒性效應(yīng)，從而促進(jìn)了微藻的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為刺激作用.當(dāng)五氯苯酚的濃度高于1.02 μg/L時(shí)，葉綠素a含量下降，藻細(xì)胞自身不足以抵消毒物帶來(lái)的毒性作用，從而抑制了小球藻和銅綠微囊藻的生長(zhǎng)[17].

表1 草甘膦對(duì)小球藻葉綠素含量的影響

圖4表示在不同濃度草甘膦下，小球藻內(nèi)可溶性多糖和蛋白質(zhì)的變化.由圖4可知，當(dāng)草甘膦濃度為0.25 mg/L、0.5 mg/L時(shí)，小球藻內(nèi)可溶性多糖和蛋白質(zhì)的合成量均高于空白組，在0.5 mg/L時(shí)可溶性多糖和蛋白質(zhì)的含量達(dá)到最大值，分別為69.83 mg/L和442.08 mg/L；而草甘膦濃度在1 mg/L、5 mg/L、15 mg/L、30 mg/L、45 mg/L時(shí)，其合成能力受到抑制，草甘膦濃度為45 mg/L時(shí)，可溶性多糖和蛋白質(zhì)含量分別比對(duì)照組低29.30%和53.48%.與本文研究結(jié)果相似，Liu等[18]研究表明，低濃度阿莫西林(0～500 ng/L)誘導(dǎo)銅綠微囊藻蛋白質(zhì)和可溶性多糖的含量增加，分別高于對(duì)照組31.81%和43.75%.在低濃度有機(jī)磷農(nóng)藥(<1 mg/L)作用下，肋骨條藻和赤潮異彎藻內(nèi)蛋白質(zhì)的含量分別比對(duì)照組提高了28%和17%，而當(dāng)有機(jī)磷農(nóng)藥濃度高于100 mg/L時(shí)，兩種海洋微藻內(nèi)蛋白質(zhì)含量?jī)H為對(duì)照組的10%和39%[2].

圖4 草甘膦對(duì)小球藻胞內(nèi)可溶性多糖和蛋白質(zhì)含量的變化Fig.4 Change of intracellular protein and polysaccharides from Chlorella vulgaris under the stress of glyphosate

2.4 草甘膦對(duì)小球藻GS和ACP酶活性的影響

小球藻對(duì)水體中的氮磷元素的消耗需要酶的調(diào)控.藻細(xì)胞主動(dòng)運(yùn)輸并吸收水體環(huán)境中的氨氮，同化為自身的大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)等，而蛋白質(zhì)的合成則需要通過(guò)谷氨酸代謝途徑完成，在其中谷氨酰胺合成酶起重要作用[19]；磷通常以正磷酸鹽的形式被藻類(lèi)或者植物吸收，酸性磷酸酶可以催化磷酸單脂的水解及釋放無(wú)機(jī)磷，密切參與磷的代謝活動(dòng)[20].

草甘膦對(duì)小球藻谷氨酰胺合成酶和酸性磷酸酶活性的影響如圖5所示.與對(duì)照組相比，當(dāng)草甘膦濃度低于0.50 mg/L時(shí)，小球藻的谷氨酰胺合成酶和酸性磷酸酶活性均高于對(duì)照組，與草甘膦對(duì)小球藻氮磷去除率的影響一致，谷氨酰胺合成酶和酸性磷酸酶活性在草甘膦濃度為0.5 mg/L時(shí)出現(xiàn)最大值，分別比對(duì)照組(266.81 U/g和783.56 U/g)高26.67%和9.08%.而當(dāng)加入草甘膦的濃度≥1 mg/L時(shí)，小球藻氨酰胺合成酶和酸性磷酸酶活性明顯低于對(duì)照組，在45 mg/L時(shí)僅為(101.79 U/g和480.97 U/g).以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：低濃度的草甘膦(<0.5 mg/L)提高了小球藻細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺合成酶和酸性磷酸酶的活性，從而提高了小球藻對(duì)氮磷的去除效率并促進(jìn)了生化組分的合成，表現(xiàn)為刺激作用；而高濃度的草甘膦(≥1 mg/L)使得谷氨酰胺合成酶和酸性磷酸酶的活性降低，從而降低了小球藻對(duì)氮磷的去除效率并阻礙了生化組分的合成，表現(xiàn)為明顯的毒性作用.

圖5 草甘膦對(duì)小球藻谷氨酰胺酶和酸性磷酸酶活性的影響Fig.5 Effect of CTAB on the GS and ACP activity of Chlorella vulgaris

2.5 草甘膦對(duì)小球藻超氧化歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性的影響

草甘膦在不同濃度的情況下對(duì)小球藻超氧化歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性的影響如圖6所示.當(dāng)草甘膦濃度分別為0.25 mg/L、0.50 mg/L時(shí)，小球藻的超氧化歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性高于對(duì)照組(1 421.06 U/g和810.47 U/g)，在0.50 mg/L時(shí)達(dá)到最大值，分別為2 190.07 U/g和1 207.77 U/g.而當(dāng)加入草甘膦的濃度為1 mg/L、5 mg/L、15 mg/L、30 mg/L、45 mg/L時(shí)，小球藻的超氧化歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性受到抑制.以上結(jié)果表明，低濃度草甘膦對(duì)小球藻超氧化歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性均有刺激作用，反映為小球藻受草甘膦氧化脅迫，機(jī)體抗氧化能力增強(qiáng)，當(dāng)草甘膦濃度≥1 mg/L時(shí)，隨著草甘膦濃度增加超氧化歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性逐漸下降，細(xì)胞的氧化損傷增強(qiáng).晁華等[21]研究表明，許多農(nóng)藥能夠抑制生物體內(nèi)抗氧化酶的活性，導(dǎo)致生物體內(nèi)活性氧自由基含量的增加，對(duì)生物體構(gòu)成氧化脅迫，由超氧化歧化酶、過(guò)氧化氫酶等組成的抗氧化系統(tǒng)能夠有效防御活性氧自由基的侵害，其活性變化可以作為微藻抵御污染物致毒脅迫能力的生物標(biāo)志物.黃健等[22]認(rèn)為污染物在低濃度范圍內(nèi)，藻細(xì)胞內(nèi)的自由基含量在一定范圍內(nèi)升高，生理生化代謝和繁殖的能力得以增強(qiáng)，表現(xiàn)為藻細(xì)胞生長(zhǎng)的毒物興奮效應(yīng).

圖6 草甘膦對(duì)小球藻超氧化歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性的影響Fig.6 The influence of glyphosate on activity of SOD and CAT in Chlorella vulgaris

2.6 草甘膦對(duì)小球藻細(xì)胞膜通透性的影響

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)首先通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，再被吸收利用轉(zhuǎn)化為生物骨架.因此，細(xì)胞膜的性質(zhì)決定了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸效果.草甘膦對(duì)小球藻細(xì)胞膜通透性的影響如圖7所示，隨著草甘膦濃度上升，細(xì)胞膜的通透性在一定范圍內(nèi)增加.當(dāng)草甘膦濃度達(dá)到最高濃度(45 mg/L)時(shí)，細(xì)胞膜相對(duì)通透性均是對(duì)照組的2.51倍.

圖7 草甘膦對(duì)小球藻細(xì)胞膜相對(duì)通透性的影響Fig.7 Effect on membrane permeability of Chlorella vulgaris under the stress of glyphosate

當(dāng)草甘膦濃度比較低(≤0.50 mg/L)時(shí)，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，草甘膦能夠加快氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入小球藻細(xì)胞膜的速度，提高細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化效率[22].當(dāng)草甘膦濃度超過(guò)1 mg/L時(shí)，細(xì)胞膜通透性進(jìn)一步增加，細(xì)胞膜被破壞，胞內(nèi)物質(zhì)外流，有毒物質(zhì)進(jìn)入并毒害細(xì)胞，隨著藻體內(nèi)有毒物質(zhì)不斷堆積，小球藻細(xì)胞活性受到危害，胞內(nèi)小球藻對(duì)氮磷的吸收受阻，從而抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng).

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

草甘膦濃度為0～0.5 mg/L時(shí)，促進(jìn)了小球藻生物量和主要生化組分的合成，提高了小球藻對(duì)氮磷的去除效率和氮磷關(guān)鍵酶(谷氨酰胺合成酶和酸性磷酸酶)、超氧化歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性，從而促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)；而草甘膦濃度≥ 1 mg/L時(shí)抑制小球藻的生長(zhǎng)、氮磷去除率和細(xì)胞活性，表現(xiàn)為毒物興奮效應(yīng)即低濃度的刺激作用和高濃度的抑制作用.細(xì)胞膜的通透性隨著草甘膦濃度增加而增大，在低濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞膜通透性的小幅度增加有益于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而當(dāng)草甘膦濃度超過(guò)1 mg/L，細(xì)胞膜通透性大幅度增加，細(xì)胞膜受到損傷，有毒物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，損害細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖.