大豆卵磷脂稀釋液中添加原花青素對(duì)山羊凍精效果的影響

范文華, 戴建軍, 張樹山, 孫玲偉, 吳彩鳳, 張德福*

(1.上海海洋大學(xué), 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 201306 上海; 2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 上海農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室, 201106 上海)

精液冷凍是長(zhǎng)期保存精子細(xì)胞活力的技術(shù)手段，后續(xù)可通過人工授精恢復(fù)畜禽生殖能力。冷凍-解凍過程易造成精子的物理和化學(xué)性損傷，在稀釋液中添加冷凍保護(hù)劑可大大降低這種損傷。卵黃(egg yolk，EY)是哺乳動(dòng)物精液冷凍稀釋液中常添加的保護(hù)劑，存在動(dòng)物源性病原微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，且其成分復(fù)雜，不易制備標(biāo)準(zhǔn)濃度的冷凍保護(hù)劑[1]。此外，卵黃中含有大量卵磷脂等脂質(zhì)，導(dǎo)致稀釋液粘度增加，抑制精子呼吸并降低精子運(yùn)動(dòng)能力[2]。因此，尋求卵黃替代物成為精液冷凍標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的必然趨勢(shì)。Salmani等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在山羊精液冷凍中使用大豆卵磷脂替代雞蛋卵黃，凍后精子活力活率可達(dá)33.8%和66.0%，與卵黃組(EY組)的35.4%和67.2%無(wú)顯著性差異，起到保護(hù)凍融后精子免受冷凍損傷的作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，2%的大豆卵磷脂可替代卵黃在山羊精液冷凍保存中進(jìn)行應(yīng)用，凍后活力和活率可達(dá)52.14%和57.44%[4]。

哺乳動(dòng)物的精子質(zhì)膜中含有較高濃度的多不飽和脂肪酸，在凍融過程中易氧化應(yīng)激產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化(lipid peroxides, LPO)反應(yīng)，或生成過量脂質(zhì)過氧化物丙二醛(malondialdehyde, MDA)導(dǎo)致線粒體的功能障礙，從而影響精子能量代謝，使精子活力下降，受胎率降低[5]。大量研究表明，在精液冷凍稀釋液中添加抗氧化劑可抑制LPO反應(yīng)，改善精子運(yùn)動(dòng)能力[6-8]。原花青素(proanthocyanidins, PC)是一種多酚類天然強(qiáng)抗氧化劑，其氧化性優(yōu)于維生素C和維生素E，能有效清除自由基，抑制ROS的形成，增強(qiáng)抗氧化能力[9]。Attia等[10]研究證實(shí)，PC具有清除自由基功能，可減輕雄性小鼠生殖細(xì)胞的突變，提高小鼠精子活力。瞿靜雯等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在兔精子獲能液中添加1 mg·mL-1PC能有效保護(hù)精子質(zhì)膜和頂體完整性，對(duì)精子獲能有明顯促進(jìn)作用。孫艷青等[12]研究表明，豬精液超低溫冷凍保存中添加40 μg·mL-1PC，精子抗氧化能力得到大幅提高。呂松潔等[13]研究發(fā)現(xiàn)，湖羊精液冷凍中添加10 μg·mL-1PC，可有效降低精子氧化損傷，提高凍精質(zhì)量。

以上凍精研究均在以雞蛋卵黃為冷凍保護(hù)劑的稀釋液中添加抗氧化劑，在山羊大豆卵磷脂冷凍稀釋液中PC添加的研究報(bào)道較少。因此，本研究通過比較添加PC對(duì)山羊凍后精子質(zhì)量、抗氧化指標(biāo)和凋亡的影響，探究大豆卵磷脂冷凍稀釋液中添加PC對(duì)山羊凍精中的抗氧化保護(hù)作用，為進(jìn)一步提高大豆卵磷脂在山羊精液冷凍中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和動(dòng)物

除特別說明外，所有試劑均購(gòu)自Sigma(美國(guó))公司。

采精用6只崇明白山羊種公羊來(lái)源于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食草動(dòng)物綜合試驗(yàn)站，年齡2～3歲，體格健壯，繁殖性能優(yōu)良。

1.2 稀釋液的配制

基礎(chǔ)稀釋液的配制：稱取檸檬酸1.825 2 g、葡萄糖0.504 4 g和 TRIS 3.634 2 g，溶解后加入200 IU·mL-1雙抗(遠(yuǎn)征藥業(yè)，石家莊)、6 mL甘油，混勻，定容至100 mL。

試驗(yàn)共分6組，對(duì)照組(EY組)為在基礎(chǔ)稀釋液中添加20.0%(體積分?jǐn)?shù))卵黃，試驗(yàn)組(SL0、SL1、SL2、SL3和SL4)為在基礎(chǔ)稀釋液中添加2.0%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))大豆卵磷脂，再添加0、10、20、40、60 μg·mL-1的PC(源葉生物公司，純度 95%)。

1.3 精液采集及處理

1.3.1精液采集 山羊精液采用假陰道法采集[14]，經(jīng)常規(guī)檢測(cè)，活力在80%以上可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2精液冷凍 將6只種公羊精液混合，按照精液與稀釋液1∶3的比例稀釋混勻，移入4℃冰箱中緩慢降溫平衡2 h。平衡后的樣品在4 ℃條件下裝入0.25 mL細(xì)管，封口后于液氮面上方3 cm處熏蒸15 min，投入液氮保存。

1.3.3精液解凍 從液氮中取出細(xì)管樣品，迅速放于70 ℃水浴鍋中解凍5 s，用稀釋液1∶10稀釋，37 ℃孵育10 min后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 精子質(zhì)量檢測(cè)

1.4.1精子活力與活率 解凍后精液孵育10 min，輕輕混勻，取10 μL精液滴在預(yù)熱的邁朗精子計(jì)數(shù)板中，置于37 ℃恒溫載物臺(tái)上，使用邁朗精液自動(dòng)分析儀在200×光學(xué)顯微鏡(SJ-TMDI608，邁朗)下隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)算精子活力和活率。

(1)

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1.4.2精子質(zhì)膜完整率檢測(cè) 采用低滲腫脹試驗(yàn)法(hypoosmotic swelling test，HOST)檢測(cè)精子質(zhì)膜完整性[15]。HOST低滲溶液(0.9 g果糖、0.49 g檸檬酸鈉，溶于100 mL雙蒸水中)37 ℃預(yù)熱。取50 μL樣品添加到500 μL低滲溶液中，37 ℃水浴1 h，于200×光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察3個(gè)視野，計(jì)算彎尾精子數(shù)與總精子數(shù)的比例。

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1.4.3精子頂體完整率檢測(cè) 采用吉姆薩染色法[16]測(cè)定精子頂體完整率。解凍后精液使用預(yù)熱的無(wú)甘油基礎(chǔ)稀釋液50倍稀釋，取10 μL滴于載玻片上涂片，風(fēng)干。甲醇固定，風(fēng)干后沖洗干凈。吉姆薩染色12 h，沖洗干凈，風(fēng)干后于油鏡下隨機(jī)觀察3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)頂體完整染成紫紅色精子數(shù)和總精子數(shù)比例，計(jì)算精子頂體完整率。

(4)

1.4.4精子線粒體活性檢測(cè) 使用羅丹明123(Rh 123)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染法檢測(cè)精子線粒體活性。解凍后精液稀釋至1.5×106mL-1，加入10 μL羅丹明123(1 μmoL·L-1)和10 μL碘化丙啶(1 mg·mL-1)混合， 37 ℃避光孵育30 min 后，吸取10 μL樣品制片。在400×倒置熒光顯微鏡(卡爾ZEISS，Axiovert A1)波長(zhǎng)520 nm下隨機(jī)選取四個(gè)視野(n≥200)觀察，精子呈現(xiàn)紅色熒光為死精，精子尾部呈現(xiàn)綠色熒光有線粒體活性[17]，統(tǒng)計(jì)精子線粒體活性比率。

(5)

1.4.5精子抗氧化指標(biāo)檢測(cè) 使用碧云天的活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)試劑盒，分別檢測(cè)解凍后精子的抗氧化指標(biāo)。

1.4.6精子凋亡指標(biāo)檢測(cè) 使用CASPACETMFITC-VAD-FMK原位熒光標(biāo)記試劑盒(Promega公司)和TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天)檢測(cè)凍后精子總caspase和TUNEL凋亡率。每200 μL精液加入4%多聚甲醛，室溫固定1 h。PBS清洗后加入0.1% Triton冰浴2 min，PBS清洗后分別進(jìn)行凋亡檢測(cè)?？俢aspase檢測(cè)時(shí)加入50 μL CASPACETMFITC-VAD-FMK檢測(cè)液，混勻后37 ℃避光孵育5 min。TUNEL檢測(cè)時(shí)加入50 μL TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育1 h。樣品經(jīng)PBS洗滌后懸浮，利用流式細(xì)胞儀(貝克曼庫(kù)爾特，F(xiàn)C500 MPL)測(cè)定凋亡精子數(shù)，計(jì)算凋亡率。

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1.5 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)三次，每次每組至少解凍兩管。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，P< 0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加原花青素對(duì)山羊凍精質(zhì)量的影響

由表1可知，添加PC濃度為40 μg·mL-1(SL3組)時(shí)，解凍后精子各項(xiàng)指標(biāo)最高，活率、活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率分別為58.49%、53.45%、50.46%、55.37%，與未添加PC的EY組(20%卵黃)和SL0組(2%大豆卵磷脂)差異顯著(P<0.05)。SL3組質(zhì)膜完整率與SL2組差異不顯著(P>0.05)，但活率、活力和頂體完整率均顯著高于SL2組(P<0.05)。當(dāng)PC濃度增加至60 μg·mL-1(SL4組)時(shí)，凍精質(zhì)量最差，各項(xiàng)指標(biāo)與EY組(20%卵黃)和SL0組(2%大豆卵磷脂)相比均顯著下降(P<0.05)?？梢姡诖蠖孤蚜字♂屢褐刑砑?0 μg·mL-1PC可有效提高山羊凍融后精液質(zhì)量。

表1 不同濃度原花青素下山羊凍精質(zhì)量Table 1 Quality of goat frozen semen under different concentrations of PC

注：尾部彎曲為質(zhì)膜完整；尾部未彎曲為質(zhì)膜不完整。Note：Cured tail means membrane-intact sperm; unbent tail means membrane-damaged sperm.圖1 精子尾部卷曲Fig.1 Sperm tail curling

2.2 添加原花青素對(duì)凍后山羊精子線粒體活性的影響

添加不同濃度PC對(duì)山羊精子凍后線粒體活性影響結(jié)果如圖3所示。當(dāng)大豆卵磷脂冷凍保護(hù)稀釋液添加PC濃度為40 μg·mL-1PC(SL3組)時(shí)，解凍后精子線粒體活性顯著高于EY組(20%卵黃)和SL0組(2%大豆卵磷脂)(P<0.05)。當(dāng)濃度增加至60 μg·mL-1(SL4組)時(shí)，線粒體活性顯著下降(P<0.05)，說明大豆卵磷脂稀釋液中添加PC具有濃度效應(yīng)， 當(dāng)PC添加濃度為40 μg·mL-1時(shí)，解凍后山羊精子線粒體活性得到顯著提高。

圖2 精子頂體完整性Fig.2 Sperm acrosome integrity

2.3 添加原花青素對(duì)山羊凍精抗氧化能力的影響

大豆卵磷脂稀釋液中添加PC質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1(SL3組)時(shí)，ROS和MDA值最低，分別為0.435和7.03 nmol·L-1，與EY組和SL0組相比差異顯著(P<0.05)；SL3組的SOD和GSH-PX值最高，分別為224.87 U·mL-1和129.6 U·L-1，顯著高于EY組和SL0組。當(dāng)添加PC質(zhì)量濃度至60 μg·mL-1(SL4組)時(shí)，SOD和GSH-PX酶活力大幅下降，ROS和MDA值上升，表現(xiàn)為氧化損傷，與EY組和SL0組差異顯著(P<0.05)?？梢?，在大豆卵磷脂稀釋液中添加最適濃度外源抗氧化劑PC能有效提高山羊凍精抗氧化能力，減少精子氧化損傷。

注：圖中不同字母表示差異顯著(P <0.05)。Note:Different letters in the figure mean significant difference between the treatments (P <0.05).圖3 精子線粒體活性Fig.3 Mitochondrial activity of sperm

注：圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters in the figure mean significant difference between the treatments (P<0.05).圖4 不同濃度原花青素對(duì)山羊凍精抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of different concentrations of PC on the antioxidant capacity of frozen-thawed goat semen

2.4 添加原花青素對(duì)山羊冷凍-解凍精子凋亡的影響

大豆卵磷脂稀釋液中添加PC對(duì)山羊凍精凋亡影響結(jié)果見表2。當(dāng)PC添加濃度為40 μg·mL-1(SL3組)時(shí)，經(jīng)caspase原位熒光染色和TUNEL檢測(cè)后流式細(xì)胞儀測(cè)定精子凋亡率(圖5)，總caspase凋亡率和TUNEL凋亡率均最低，且與EY和SL0組凍融精子細(xì)胞凋亡率相比差異顯著(P<0.05)；繼續(xù)提高PC添加濃度至60 μg·mL-1(SL4組)時(shí)，凍精的凋亡比例迅速增加，與40 μg·mL-1(SL3組)差異顯著(P<0.05)。結(jié)果說明，當(dāng)添加PC濃度為40 μg·mL-1時(shí)解凍后山羊精子凋亡率最低，對(duì)提高精子細(xì)胞抗凋亡具有積極影響。

表2 不同原花青素下山羊冷凍-解凍精子凋亡率Table 2 Quality of goat frozen-thawed semen under different concentrations of PC

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)解凍后精子凋亡率Fig.5 D-plots and histogram analysis of spermatozoa apoptosis rate after thawed

3 討論

3.1 原花青素的應(yīng)用對(duì)山羊凍精常規(guī)品質(zhì)的影響

本研究在大豆卵磷脂稀釋液中添加原花青素(PC)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)提高山羊凍精的抗凍能力具有濃度依賴效應(yīng)，添加不同濃度PC后凍精品質(zhì)常規(guī)指均有差異。結(jié)果顯示，添加 40 μg·mL-1的PC能顯著提高山羊凍精質(zhì)量，解凍后精子活力、活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和線粒體活性最高，分別達(dá)58.49%、53.45%、50.46%、55.37%和55.16%，顯著高于卵黃組和未添加PC組，這可能是由于PC中的酚性羥基被氧化釋放出H+，競(jìng)爭(zhēng)性的與自由基及氧化物結(jié)合，緩解精子細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。該結(jié)果與呂松潔等[13]以卵黃為基礎(chǔ)稀釋液中的研究結(jié)果相一致，其發(fā)現(xiàn)10 μg·mL-1的PC可提高湖羊的凍精效果。精子質(zhì)膜中多不飽和脂肪酸所含雙鍵是維持膜流動(dòng)性和精子活力所必需的化學(xué)鍵，ROS異常增加可破壞雙鍵，由于精子質(zhì)膜中缺乏相關(guān)細(xì)胞質(zhì)酶，無(wú)法修復(fù)由ROS引起的損傷，致使脂類化合物聚集，精子活率和活力下降[18-19]。PC作為一種高效抗氧化劑，其高分子結(jié)構(gòu)中的二羥酚基可與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，使自由基失活，減少ROS含量，有效降低線粒體膜和脂質(zhì)膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[20]。

3.2 原花青素的應(yīng)用對(duì)山羊凍精抗氧化性的影響

孫艷青等[12]研究表明，豬精液凍存中PC最佳添加濃度為40 mg·L-1;李方舟[21]研究發(fā)現(xiàn)，在山羊精液低溫保存中葡萄籽原花青素的最適添加濃度為30 mg·L-1。本研究結(jié)果顯示，添加一定濃度的PC可改善解凍后精子細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化酶活性，有效降低ROS和MDA含量，當(dāng)添加PC濃度為40 μg·mL-1時(shí)，SOD和GSH-PX水平最高，ROS和MDA含量最低。PC最適添加濃度不同可能與不同物種稀釋液配方和保存方式有關(guān)。上述研究均證實(shí)PC對(duì)精子保存中抗氧化作用有顯著提高,這可能與PC的結(jié)構(gòu)和抗氧化保護(hù)機(jī)制有關(guān)。一方面，PC可參與精子質(zhì)膜磷脂、花生四烯酸的代謝和蛋白質(zhì)磷酸化，降低脂質(zhì)過氧化損傷[22]；另一方面PC結(jié)構(gòu)中的酚羥基會(huì)在氧化后釋放，優(yōu)先與自由基結(jié)合形成惰性化合物，降低精子細(xì)胞內(nèi)MDA含量[23]。這與涂瓏瓏[24]研究結(jié)果相一致，其發(fā)現(xiàn)PC可通過降低脂質(zhì)過氧化水平，緩解小鼠精子由4-硝基酚誘導(dǎo)的毒性損傷和生殖損傷的。SOD和GSH-PX作為哺乳動(dòng)物精子細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，SOD可將超氧化物陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，有效清除自由基；GSH-PX可清除ROS，且在DNA損傷的修復(fù)中也發(fā)揮重要作用[25]。Yousef等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PC可有效提高細(xì)胞中GSH、SOD和CAT(catalase)等抗氧化酶活性，也有研究將大鼠離體組織與PC共浴，結(jié)果表明大鼠組織中MDA含量顯著下降[27]，與本研究結(jié)果一致。

3.3 原花青素的應(yīng)用對(duì)凍融后山羊精子凋亡的影響

Caspase酶家族活化是細(xì)胞發(fā)生凋亡的中心環(huán)節(jié)，存在于多數(shù)凋亡途徑中，對(duì)Caspase酶水平的檢測(cè)來(lái)評(píng)估精子早期凋亡水平[28]。精子細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂通常由凋亡異常引起，檢測(cè)DNA鏈的完整性是評(píng)估精子質(zhì)量的重要指標(biāo)，TUNEL法可通過非放射性核素方法檢測(cè)凋亡晚期過程中DNA斷裂情況[29]。本研究在山羊精液冷凍過程中添加40 μg·mL-1PC，解凍后精子細(xì)胞caspase凋亡率和TUNEL凋亡比例顯著降低，證實(shí)了大豆卵磷脂稀釋液中添加PC對(duì)山羊冷凍精液的抗凋亡保護(hù)作用。添加40 μg·mL-1PC組解凍后精子細(xì)胞TUNEL凋亡率(41.36%)低于caspase凋亡率(54.33%)，可能是由于凍融后進(jìn)入早期凋亡的精子細(xì)胞較高于中晚期凋亡的精子。而凍精稀釋液中添加一定濃度PC后，精子凋亡率明顯下降，可能與PC能夠降低p53基因表達(dá)，增加抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)含量，從而減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。李華文等[30]研究發(fā)現(xiàn)，PC可通過P53和caspase-3途徑抑制肝細(xì)胞非正常凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活率，這與本研究結(jié)果一致。

有關(guān)花青素毒性和安全性研究報(bào)道較少。瞿靜雯等[11]研究PC對(duì)兔精子獲能發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PC的添加濃度大于1.0 mg·mL-1時(shí)，導(dǎo)致精子頂體反應(yīng)率下降。本研究中增加PC濃度至60 μg·mL-1后，PC開始表現(xiàn)為對(duì)精子的毒副作用，表現(xiàn)為解凍后精子活率、活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整率下降?？赡芘c高濃度的PC添加打破了精子細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)，引發(fā)過度氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)精子細(xì)胞構(gòu)象和完整性發(fā)生不可逆損傷有關(guān)。

綜上所述，在山羊精液冷凍過程中，PC在大豆卵磷脂稀釋中的添加具有濃度依賴效應(yīng)，40 μg·mL-1的PC對(duì)山羊凍精有顯著抗氧化保護(hù)作用，可通過降低氧化損傷和細(xì)胞凋亡、提高線粒體功能，從而達(dá)到提高冷凍效率的目的。高濃度的PC則表現(xiàn)為對(duì)冷凍精液的毒性作用。