泛素/26S蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)作物種子大小的研究進展

崔超, 趙阿慧, 李芳, 高翔,2*, 邢玲玲,董劍,2, 趙萬春,2, 楊明明,2*

(1.西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院, 陜西 楊凌 712100; 2.陜西省小麥新品種培育工程研究中心, 陜西 楊凌 712100; 3.博愛縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 河南 焦作 454450)

高產(chǎn)是作物育種永恒不變的目標。對于禾谷類作物，種子大小和構(gòu)型是影響產(chǎn)量的重要因素[1]。種子大小是由多基因控制的數(shù)量性狀，受多種途徑的調(diào)控，包括泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin/26S proteasome system，UPS)、G蛋白信號、絲裂原活化蛋白激酶信號、植物激素感知和體內(nèi)平衡以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等[1-2]。野生植物為了繁衍后代，大多都維持著小種子的特性。但是，水稻、小麥、玉米等以收獲種子為目標的糧食作物，在不斷的人為選擇和馴化過程中，籽粒逐漸變大。隨著人口不斷增長，研究作物種子大小及其調(diào)控機理對人類糧食安全至關(guān)重要。

成熟完整的種子由胚、胚乳和種皮組成[1-2]。植物雙受精過程中，一個精細胞與卵細胞結(jié)合形成受精卵，發(fā)育成二倍體的胚；另一個精細胞與中央細胞結(jié)合，發(fā)育成三倍體的胚乳；珠被發(fā)育成種皮。胚、胚乳和種皮的協(xié)調(diào)生長決定著種子的大小[1]。小麥、玉米、水稻等禾本科植物種子的種皮與果皮緊密連接在一起，難以區(qū)分，因此，果皮與種皮的空腔大小共同決定了種子的大小。果皮由子房壁發(fā)育而來，種皮由珠被發(fā)育而來，通常子房壁和珠被均由母體遺傳物質(zhì)控制。因此，種子大小由母體的遺傳物質(zhì)與合子的遺傳物質(zhì)共同決定[1-2]。另外，小麥、水稻等植物包裹種子的穎殼也由母體遺傳物質(zhì)控制[1]，由此表明，母體遺傳物質(zhì)在種子大小的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)普遍存在于真核生物蛋白質(zhì)翻譯后的修飾過程中，據(jù)報道，擬南芥中約6%的基因組參與其中[3-6]。該系統(tǒng)由泛素、泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)、26S蛋白酶體和去泛素化酶組成[3-5]。其中，泛素連接酶在該系統(tǒng)中起特異識別作用，通過在目標蛋白上連接不同數(shù)量的泛素進行泛素化修飾來介導(dǎo)目標蛋白的降解和改變蛋白活性等，對植物非生物脅迫響應(yīng)、信號傳遞、種子大小、開花時間、育性等方面起著重要作用[3-5]。

1 泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)組成

1.1 泛素

泛素(ubiqutin，Ub)于1975年首次被純化，是一種高度保守的低分子量蛋白質(zhì)，廣泛存在于真核細胞中，由76個氨基酸組成，分子量約為8.5 kD[4-5]，可共價連接到目標蛋白，導(dǎo)致目標蛋白以依賴ATP和Mg2+的方式降解[5]。泛素的穩(wěn)態(tài)受去泛素化酶的嚴格調(diào)控[5]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有14個泛素編碼基因，可分為三種類型：多聚泛素基因、類泛素基因和泛素延伸基因。其中，多聚泛素基因和類泛素基因由228 bp的單泛素串聯(lián)重復(fù)組成[4]。在單個泛素分子中包括7個賴氨酸殘基(Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48、Lys63)組成的ε-氨基或泛素N端氨基，它們可與下一個泛素的C端羧酸相連形成聚合泛素鏈，不同部位的連接參與不同的調(diào)控[4]。目標蛋白可以在一個或多個位點連接一個泛素分子(單泛素化)，也可以在一個或多個位點連接泛素鏈(多泛素化)[5]。

1.2 泛素激活酶

泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme，E1s)大小為110～125 kD[6]，可以將失活的泛素活化。不同生物中泛素激活酶的編碼基因數(shù)量不同，在酵母中含有1個[4]，擬南芥和煙草(Nicotianatabacum)中存在2個[4-5]，小麥(Triticumaestivum)中發(fā)現(xiàn)3個[5]，而大豆(Glycinemax)中報道了4個[4,6]。E1s含有四個不同的結(jié)構(gòu)域：兩個ThiF同源基序組成的腺苷酸化結(jié)構(gòu)域、兩個半結(jié)構(gòu)域(first catalytic cysteine half-domain，F(xiàn)CCH；second catalytic cysteine half-domain，SCCH)組成的催化半胱氨酸結(jié)構(gòu)域、四螺旋束結(jié)構(gòu)域(four-helix bundle，4HB)和C末端泛素折疊結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-fold domain，UFD)[4,6]。E1s的C末端泛素折疊結(jié)構(gòu)域可特異性識別同源泛素結(jié)合酶[6]。

1.3 泛素結(jié)合酶

泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2s)中有一個保守的半胱氨酸殘基作為活性位點與泛素分子(Ub)形成硫酯鍵，泛素活化酶E1將泛素轉(zhuǎn)移到E2的半胱氨酸活性位點上，形成Ub-E2復(fù)合體。E2s的半胱氨酸(Cys)殘基位于高度保守的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-conjugating，UBC)[4,6]。在擬南芥中有8種UBC蛋白缺乏硫酯形成所需的活性位點Cys殘基[6]。起初，E2s被認為是起輔助作用的“泛素載體”，而最近研究表明，E2s可以控制泛素鏈從起始到延伸的轉(zhuǎn)換，并控制形成泛素鏈的拓撲結(jié)構(gòu)，從而決定被修飾目標蛋白的使命[6]，例如：修復(fù)DNA、調(diào)控植物生長發(fā)育、響應(yīng)脅迫等[4]。

1.4 泛素連接酶

泛素連接酶(ubiquitin-ligase enzymes，E3s)在蛋白質(zhì)的泛素化過程中起特異性識別目標蛋白的關(guān)鍵性作用。擬南芥中約5%的基因組與泛素連接酶有關(guān)[4]，大豆中有1 356個基因與E3s相關(guān)[6]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域可以將E3s分為四大類：HECT(homologous to the E6-AP carboxy terminus)結(jié)構(gòu)域家族、RING(really interesting new gene)結(jié)構(gòu)域家族、U-box結(jié)構(gòu)域家族和CRLs(cullin-RING ubiquitin ligases)結(jié)構(gòu)域家族[3-6]。其中，HECT型、RING型和U-box型為單亞基E3s，而CRLs型為多亞基E3s[3-6]。

1.4.1HECT型E3s HECT型E3s的C端為α/β結(jié)構(gòu)[4]，其保守結(jié)構(gòu)域HECT約由350個氨基酸組成[3-4,6]，具催化作用，其催化活性位點為Cys820，介導(dǎo)Ub從E2到目標蛋白的直接轉(zhuǎn)移[4-5]。HECT的典型結(jié)構(gòu)為E6-AP[4]。擬南芥中有7種HECT蛋白，分別為UPL1～UPL7[5]。

1.4.2RING型E3s RING型E3s的結(jié)構(gòu)域約由40～60個氨基酸組成，富含Cys[3,5]，協(xié)調(diào)兩個鋅原子[5]。擬南芥中有超過470種蛋白質(zhì)包含RING結(jié)構(gòu)域[5]。研究證明，RING型E3s在植物不同發(fā)育過程中均有重要作用，包括種子萌發(fā)、生長、根發(fā)育、光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、配子形成、器官大小和對非生物脅迫的響應(yīng)等[3-5]。RING型E3s數(shù)量眾多，在擬南芥中有469個基因編碼RING型E3s，大豆中有760個[6]。目前RING型E3泛素連接酶的研究已逐漸成為熱點[3-6]。擬南芥中已鑒定出7種類型的RING結(jié)構(gòu)域，包括兩種典型的RING類型(RING-HC和RING-H2)和五種修飾的RING結(jié)構(gòu)域類型(RING-v、RING-C2、RING-D、RING-S/T和RING-G24-27)[7]。與HECT型E3s相反，RING結(jié)構(gòu)域主要通過8個氨基酸與Zn2+的螯合形成共價鍵來間接轉(zhuǎn)移泛素[3]。除此之外，RING型E3s也參與多亞基E3s的形成[4]。

1.4.3U-box型E3s U-box結(jié)構(gòu)域由約70個氨基酸組成，缺乏經(jīng)典的鋅螯合Cys和組氨酸(His)殘基[3]，主要通過鹽橋、離子螯合以及氫鍵從E2s轉(zhuǎn)移泛素至目標蛋白，進行泛素化修飾[4]。植物中有較多的U-box型E3s[3]。其中，擬南芥檢測到64個成員，水稻中有77個成員[3]，大豆中有124個成員[6]，這類蛋白可能參與植物自交不親和、種子萌發(fā)、花期、葉綠體發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)等[5]。

1.4.4CRLs型E3s CRLs型E3s是多亞基E3s，由cullin骨架蛋白、E2結(jié)合蛋白RBX1 (RING box 1)和結(jié)合cullin的底物識別亞基構(gòu)成[3]。CRLs型E3s又可分為四個亞家族：SCF(SKP1-Cullin1-F-box)、BTB(Bric-a-brac-Tram track-Broad)、DDB(DNA Damage-Binding domain-containing)和APC(anaphase-pro-moting complex)[4-5]。其中，SCF亞型E3s由SKP1(sphase kinase-associated protein 1)、CUL1(cullin 1)、RBX1(RING-box 1)和FBX(F-box)蛋白組成，F(xiàn)BX蛋白決定底物特異性[5]。擬南芥中有超過700個基因參與CRLs型E3s，部分基因參與植物激素信號通路、植物發(fā)育和各種非生物脅迫響應(yīng)[5]等。擬南芥中已鑒定的5種經(jīng)典cullin蛋白(CUL1、CUL2、CUL3a、CUL3b和CUL4)均屬于E3s復(fù)合物的組分[3]。

1.5 26S蛋白酶體

26S蛋白酶體在真核細胞中負責蛋白質(zhì)的降解，以消耗ATP的形式特異性將靶蛋白降解成由7～9個氨基酸殘基組成的多肽。結(jié)構(gòu)上由19S調(diào)節(jié)亞基和20S核心亞基組成[5,8]。其中，19S調(diào)節(jié)亞基能夠識別帶有泛素鏈標記的蛋白質(zhì)底物并將其去折疊，然后將去折疊后的蛋白質(zhì)底物運送至20S核心亞基中進行降解[8]。26S蛋白酶體參與了植物的絕大多數(shù)生命活動[8]。它能將含有泛素鏈(≥4個泛素分子)的目標蛋白降解為較小的肽段，而釋放的泛素分子則被回收[5]；對于單泛素化蛋白質(zhì)無法進行降解，但單個泛素分子通過與泛素受體蛋白結(jié)合會影響其他修飾蛋白的功能或活性，進而調(diào)控植物的生長發(fā)育[5]。

1.6 去泛素化酶

去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)具有從線性串聯(lián)重復(fù)序列中產(chǎn)生游離泛素的功能，還能夠通過水解泛素分子之間的異肽鍵來修剪泛素鏈，以及從蛋白質(zhì)中去除共價結(jié)合的泛素。DUBs是一個大的蛋白質(zhì)家族，根據(jù)其特有的催化結(jié)構(gòu)域可分為五類：泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific protease，USP/UBP)、泛素碳末端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolase，UCH)、卵巢腫瘤結(jié)構(gòu)域蛋白酶(ovarian tumor domain protease，OTU)、Machado-Jo-seph疾病蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白酶(machado-jo-seph disease protein domain protease，MJD)和JAMM基序蛋白酶(jab1/mpn/mov34 protease，JAMM)[9]。

2 泛素介導(dǎo)的26S蛋白酶體降解途徑

UPS系統(tǒng)由Ub、E1s、E2s、E3s、DUBs、26S蛋白酶體組成[3-5](圖1)。首先，細胞質(zhì)與細胞核中的E1s在ATP參與下將失活的Ub激活；Ub的C末端和E1s的Cys殘基之間以硫酯鍵結(jié)合(E1-Ub)。然后，硫酯連接的泛素(E1-Ub)被轉(zhuǎn)移到E2s的Cys殘基活性位點上，再經(jīng)過硫酯鍵進行結(jié)合，形成E2-Ub。此時E3s與目標蛋白和E2-Ub形成復(fù)合物，直接或間接介導(dǎo)活化的Ub轉(zhuǎn)移到目標蛋白上，使Ub分子C端的甘氨酸(Gly)殘基與目標蛋白的賴氨酸(Lys)殘基之間形成異肽鍵[5]。Cys殘基是整個E3s具有活性的關(guān)鍵殘基。此外，包括半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸在內(nèi)的殘基也可以被泛素修飾[5]。直接轉(zhuǎn)移的E3s為HECT型E3s，可將Ub轉(zhuǎn)移至E3s，形成E3-Ub，E3-Ub中E3與目標蛋白結(jié)合后進行旋轉(zhuǎn)，使得Ub與目標蛋白進行結(jié)合；間接轉(zhuǎn)移的E3s有RING型、U-box型和Cullin-based型，E2-Ub直接與目標蛋白結(jié)合，E3發(fā)揮橋梁作用。最后，含有多聚泛素鏈(≥4個泛素分子)修飾的目標蛋白被26S蛋白酶體降解，釋放Ub[3-6]。

3 泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)節(jié)器官和種子大小

3.1 泛素受體類基因

擬南芥AtDA1是一個泛素受體類基因，其編碼蛋白包含兩個泛素相互作用的基序(ubiquitin iteraction motifs, UIM)結(jié)構(gòu)域、一個LIM結(jié)構(gòu)域和一個C末端肽酶結(jié)構(gòu)域[10-11]。AtDA1對于種子大小具有重要作用[10,12-19]。它通過限制母體珠被中的細胞增殖來控制種子大小[10-11,14]。該基因第358位點的堿基由G突變?yōu)锳(AtDA1R358K)后，導(dǎo)致原本的精氨酸變異為賴氨酸，使得突變體種子和器官的大小增加[10]。DAR1和DAR2(DA1的兩個同源基因)也具有調(diào)控種子大小的作用。

甘藍型油菜BnDA1基因發(fā)生突變后，突變體Bnda1的種子產(chǎn)量和生物量得到提高。過表達AtDA1R358K增加了轉(zhuǎn)基因油菜的千粒重和器官大小，提高了單株產(chǎn)量。由此可見，BnDA1和AtDA1在調(diào)控種子和器官大小方面具有相似的功能[12]。

玉米ZmDA1或ZmDAR1發(fā)生突變后，突變體Zmda1和Zmdar1穗長增加，導(dǎo)致行粒數(shù)增加。且突變體比野生型具有更加發(fā)達的基生胚乳轉(zhuǎn)移細胞層(basal endosperm transfer cell layer，BETL)，增強了淀粉合成酶基因的表達，改善了糖向庫器官的輸入以及玉米籽粒中淀粉的合成。ZmDAR1主要在玉米胚乳發(fā)育中起作用，ZmDA1在胚發(fā)育中起重要作用，糖與淀粉含量的增加使胚乳或胚增加，導(dǎo)致籽粒重量增加。這與AtDA1/AtDAR1調(diào)控種子大小存在一定差異，可能是由于兩個物種調(diào)控途徑中降解的底物不同，ZmSWEET4c可能是ZmDA1的潛在底物[13]。

普通小麥TaDA1基因通過限制母體果皮細胞的增殖來負調(diào)控小麥籽粒大小。TaDA1-A與TaGW2-B對粒重具有加性效應(yīng)，同時下調(diào)TaDA1和TaGW2的表達使小麥的籽粒大小與重量增加。TaDA1位于小麥2A、2B和2D染色體，TaDA1-B和TaDA1-D主要在營養(yǎng)器官(如葉和根)中表達，而TaDA1-A主要在生殖器官(如幼穗)中表達，可能在籽粒重量和大小方面起重要作用[14]。DA1基因第358位點發(fā)生突變會抑制DA1和DAR1蛋白的活性，使得擬南芥、油菜和玉米的種子大小增加[10,12-13]。但是，這種突變至今還沒有在自然變異中被發(fā)現(xiàn)。Liu等[14]研究表明，啟動子區(qū)域的變異會改變TaDA1-A三種單倍型的表達水平。

水稻中鑒定出4個同源基因OsDA1、OsDAR2、OsDAR3和OsDAR4[15,18]。這些同源基因可能作為轉(zhuǎn)錄因子來正向調(diào)控水稻的粒寬和粒長，從而增加千粒重和單株產(chǎn)量[15,18]。李愛芹等[17]研究表明，OsDA1基因的啟動子區(qū)存在多個不同激素和逆境信號響應(yīng)的順式作用元件，但這些元件的類型與擬南芥DA1基因的順式作用元件有所不同，OsDA1與AtDA1可能在表達調(diào)控上存在差異[15,17-18]；OsDA1基因不僅能夠調(diào)控種子等器官的大小和發(fā)育[17]，還可能與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境響應(yīng)有關(guān)[16-17]。郝健均[19]指出，OsDA1R310K的過量表達使轉(zhuǎn)基因植株的器官(營養(yǎng)器官和生殖器官)和種子增大。

對栽培大豆(Glycinemax,G.ma)和野生大豆(Glycinesoja,G.so)的DA1基因在序列和表達水平進行比較，GsoDA1基因在根、莖和葉中的表達水平高于生殖器官和發(fā)育中的果實，該基因的過表達影響了轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的萌發(fā)和對鹽脅迫的敏感性，但對種子大小無顯著影響[16]，這與擬南芥[10]、甘藍型油菜[12]、玉米[13]和普通小麥[14]中的研究結(jié)果不一致。由此可見，DA1基因在植物中可能具有多種功能，同源基因間的保守性及其功能受親緣關(guān)系遠近的影響[19]。

3.2 泛素連接酶類基因

3.2.1GW2基因OsGW2是水稻中發(fā)現(xiàn)控制粒寬和粒重的RING型E3類主效基因，在不同組織中均有表達。OsGW2基因的功能是通過泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解調(diào)控細胞分裂，改變小穗穎殼中的細胞數(shù)量。該基因第4個外顯子發(fā)生1 bp的缺失突變，形成終止密碼子，使該基因提前終止(在第310個氨基酸處被截斷)，導(dǎo)致粒寬、粒重和籽粒灌漿速率增加[7]。OsGW2與幾丁質(zhì)酶14和磷酸甘油酸激酶相互作用，但不會使這些蛋白質(zhì)泛素化，而是通過調(diào)節(jié)參與碳水化合物代謝的蛋白質(zhì)活性或穩(wěn)定性以及種子發(fā)育過程中二硫鍵的形成來控制糊粉層的發(fā)育，直接調(diào)控種子大小[20]。OsGW2與膨脹素(一種促進細胞生長的細胞壁松弛蛋白)共定位于細胞核， OsGW2通過其E3活性促進膨脹素降解而負調(diào)控種子大小[21]。在日本品種(Koshihikari)中發(fā)現(xiàn)一個突變體KEMS39，其籽粒大小和產(chǎn)量顯著增加，并且節(jié)間較厚，耐貯藏性和抗倒伏能力提高，研究表明，該突變體的OsGW2基因第6個內(nèi)含子的3′剪接位點發(fā)生突變，導(dǎo)致mRNA中存在67 bp的缺失[22]。

玉米中發(fā)現(xiàn)了OsGW2的兩個同源基因：ZmGW2-CHR4和ZmGW2-CHR5。ZmGW2-CHR4啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，該多態(tài)性與籽粒寬度和百粒重顯著相關(guān)，ZmGW2-CHR4和ZmGW2-CHR5其他區(qū)域的SNPs(插入/缺失多態(tài)性)也發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)量性狀(籽粒長度、籽粒厚度、籽粒寬度和百粒重)顯著相關(guān)[23]。ZmGW2可以被高鹽(NaCl)和脫落酸(abscisic acid，ABA)誘導(dǎo)[24-25]，具有抗旱和抗冷害的能力，將過表達ZmGW2載體和AtGW2RNA干擾(RNA interference，RNAi)載體轉(zhuǎn)入擬南芥發(fā)現(xiàn)，AtGW2RNA干擾植株后代的籽粒比過表達ZmGW2轉(zhuǎn)基因后代的更大，千粒重更高，表明ZmGW2具有負調(diào)控種子大小及粒重的作用[24-25]；非生物脅迫處理后，ZmGW2轉(zhuǎn)基因植株長勢均優(yōu)于野生型，表明其在逆境脅迫響應(yīng)中也發(fā)揮作用[24]。

大豆GmGW2全長8 467 bp，包含8個外顯子和7個內(nèi)含子，編碼431個氨基酸，不含跨膜結(jié)構(gòu)域及信號肽，編碼具有Zinc finger和RING-type結(jié)構(gòu)域(第50～100個氨基酸)的不穩(wěn)定親水蛋白[26-27]。

小麥TaGW2-6A的啟動子區(qū)存在2個SNPs：Hap-6A-A(-593A和-739G)和Hap-6A-G(-593G和-769A)。TaGW2表達水平與粒寬呈負相關(guān)，而Hap-6A-A的作用類似于水稻中功能缺失突變，導(dǎo)致粒寬和粒重增加[28-30]。Bednarek等[31]通過RNAi和基因敲除表明，TaGW2可能通過控制胚乳細胞數(shù)量正向調(diào)控小麥籽粒大小。因此，小麥和水稻中GW2基因似乎具有相反的功能[31]。Yang等[32]在蘭考大粒品種TaGW2-6A基因的第8個外顯子中發(fā)現(xiàn)了一個T堿基插入形成的終止密碼子，該單倍型在雜交分離群體中可以穩(wěn)定遺傳，該突變可以顯著提高小麥的粒寬和粒重[32]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控細胞分裂素、赤霉素、淀粉合成來提高籽粒大小[33-36]。Jaiswal等[37]在印度小麥TaGW2-6A基因的啟動子序列中鑒定出4個與千粒重顯著相關(guān)的SNPs(G/A或A/G突變)[37]。Simmonds等[38]在四倍體Kronos EMS TILLING群體TaGW2-A1基因第5個外顯子的剪接受體位點發(fā)現(xiàn)了一個從G到A的顛換，將突變等位基因Tagw2-A1回交到四倍體小麥Kronos和六倍體小麥Paragon中,能顯著增加四倍體和六倍體小麥的千粒重、粒寬和粒長，并發(fā)現(xiàn)在開花前5 d心皮長度與寬度顯著增加，推測TaGW2-A1在開花前作用于母體組織以限制種子大小[38]。利用CRISPR/cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)敲除TaGW23個同源基因(TaGW2-A1、TaGW2-B1和TaGW2-D1)中的1個、2個或3個發(fā)現(xiàn)，敲除TaGW2-B1的突變體比敲除TaGW2-A1、TaGW2-D1具有更高的粒寬、粒長和粒重，且雙突變體的千粒重顯著大于單突變體[39-40]；進一步研究表明，TaGW2通過調(diào)節(jié)籽粒外層果皮中的細胞數(shù)量和長度來負調(diào)控小麥籽粒大小[39]。Qin等[41]研究表明，六倍體小麥中TaGW2-6B對千粒重的影響大于TaGW2-6A，且兩個基因間具有加性效應(yīng)。Zhai等[42]在高千粒重親本中發(fā)現(xiàn)TaGW2-A1基因的5’側(cè)翼區(qū)缺失了114個堿基，導(dǎo)致TaGW2-A1啟動子的活性和表達量降低，對小麥千粒重和粒寬起負調(diào)控作用。

大麥中HvYrg1和HvYrg2是水稻GW2的同源基因，該基因的表達量下調(diào)導(dǎo)致千粒重增加，種子變大，且營養(yǎng)器官也發(fā)生較大變化[43]。

3.2.2EOD1/BIGBROTHER基因 擬南芥中EOD1(enhancer of DA1,EOD1)突變增強了da1-1突變體種子和器官的大小[10,44]。EOD1基因被定位于BIGBROTHER(BB)位點，編碼一種泛素連接酶，該蛋白含有一個RING型結(jié)構(gòu)域，在擬南芥活躍組織(莖、花、根的分生組織和幼嫩器官)和維管束系統(tǒng)中表達，通過E3活性降解目標蛋白來調(diào)控器官的發(fā)育，對器官形態(tài)起負調(diào)控作用[45-46]。EOD1/BB的E3活性和泛素受體活性與DA1的潛在偶聯(lián)單泛素化活性密切相關(guān)，由此表明，泛素細胞信號機制直接參與植物器官大小的調(diào)控[10]。在營養(yǎng)器官中，BB基因的表達水平與有絲分裂活動密切相關(guān)；在有絲分裂活動旺盛的器官中表達量較高，且表達量隨著細胞有絲分裂活動的減少而降低[45]。通過對P271(大籽粒)和中國春(小籽粒)小麥發(fā)育初期的籽粒進行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)一個新型BB基因Tares_1AL_B4BCDBC4A，該基因在籽粒發(fā)育初期表達量顯著增加，并且在籽粒發(fā)育過程中均維持較高水平；其氨基酸序列在487～533位置上含有一個典型的Zinc finger RING-type結(jié)構(gòu)。將該基因轉(zhuǎn)入科農(nóng)199，轉(zhuǎn)基因株系的籽粒顯著變小。除此之外，還發(fā)現(xiàn)細胞色素酶基因TaCYP78A5在中國春及P271中的表達量存在極顯著差異，推測該基因可能與BB基因相互作用參與籽粒大小的調(diào)控[47-49]。

3.2.3DA2基因 擬南芥DA2基因的編碼蛋白(DA2)具有E3活性，含有一個RING型結(jié)構(gòu)域，在根、莖、葉和花中均有表達，通過影響種子中母體珠被細胞的增殖來調(diào)控種子大小。da2-1突變體的種子顯著大于野生型，而DA2的過表達使轉(zhuǎn)基因植株的種子減小[44]。DA2的RING域與水稻GW2的環(huán)域(C5HC2)高度相似，但DA2 RING域中保守的His殘基被Asn殘基(Asn-91)取代。研究表明，DA2與DA1間存在協(xié)同互作[50]，而DA2和BB相互獨立[44]。

3.2.4SDIR1基因SDIR1基因編碼具有RING結(jié)構(gòu)域的E3 SDIR1(salt-and drought induced really interesting new gene finger 1)，在植物信號調(diào)節(jié)通路中發(fā)揮重要作用。小麥TaSDIR1-4D共檢測到2個SNP，一個位于編碼區(qū)上游序列-583 bp處(T/C)，另一個位于編碼區(qū)第4外顯子上(G/A)，使精氨酸(Arg)變?yōu)榻M氨酸(His)，兩種單倍型的千粒重和穗長存在顯著差異[51]。

SDIR1的N端含有兩個跨膜結(jié)構(gòu)域，C端含有一個C3H2C3環(huán)型結(jié)構(gòu)域，在植物中通過泛素化途徑對鹽和干旱脅迫下ABA介導(dǎo)的抗逆反應(yīng)起關(guān)鍵作用[52]。小麥TaSDIR1-4A與千粒重顯著相關(guān)，基因表達分析表明TaSDIR1-4A在旗葉中表達量最高；該基因啟動子區(qū)存在兩個核苷酸變異位點，產(chǎn)生兩種單倍型Hap-4A-1和Hap-4A-2，Hap-4A-1的表達量顯著高于Hap-4A-2，而Hap-4A-2的千粒重顯著高于Hap-4A-1，這種差異可能是由于在Hap-4A-2中TaERF3(乙烯反應(yīng)因子)對TaSDIR1-4A的轉(zhuǎn)錄阻遏作用，因此，TaSDIR1-4A對籽粒大小起負調(diào)控作用[52]。正常條件下TaSDIR1-4A的低水平表達可能有助于提高小麥產(chǎn)量；而在非生物脅迫條件下，TaSDIR1-4A的上調(diào)可能有助于脅迫響應(yīng)，但可能會降低產(chǎn)量。這表明TaSDIR1-4A是復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的中央控制單元，在不斷變化的環(huán)境條件下平衡響應(yīng)[52]。

3.2.5PUB1基因 U-box型E3s基因在逆境脅迫和激素應(yīng)答等方面起重要作用[5]。大豆GmPUB1基因編碼439個氨基酸，分子質(zhì)量為48.63 kD，GmPUB1蛋白具有U-box結(jié)構(gòu)域，在細胞核和細胞質(zhì)內(nèi)均有分布。過表達GmPUB1的轉(zhuǎn)基因擬南芥千粒重顯著提高[53]。

3.2.6后期促進復(fù)合物 后期促進復(fù)合物(anaphase-promoting complex，APC)是一種多亞基E3，通過泛素化細胞周期蛋白來調(diào)控有絲分裂進程。SAMBA是APC的負調(diào)控因子，通過影響細胞增殖來調(diào)控種子和器官的發(fā)育[54]。samba突變體表現(xiàn)出較大的種子和器官，研究顯示，其細胞周期蛋白A2;3含量增加，由此表明SAMBA通過調(diào)節(jié)A型細胞周期蛋白的穩(wěn)定性來調(diào)控種子大?。徊⑶襰amba與da1-1、eod1-2對種子和器官大小起協(xié)同作用，SAMBA可能與DA1和BB在同一途徑中對種子大小起調(diào)控作用[54]。

3.3 去泛素化酶基因調(diào)節(jié)種子大小

3.3.1SOD2/UBP15基因 擬南芥中泛素特異性蛋白酶15(ubiquitin-specific protease 15, UBP15)是一種去泛素化酶，由DA1的抑制因子2基因(suppressor 2 ofDA1,SOD2)編碼，它通過促進胚珠、珠被和發(fā)育中種子細胞增殖，在母系中正向調(diào)節(jié)種子大小[50]。sod2/ubp15突變體形成小種子，而SOD2/UBP15過表達使轉(zhuǎn)基因植株種子變大。DA1與UBP15物理結(jié)合并調(diào)節(jié)UBP15的穩(wěn)定性。UBP15的C末端區(qū)域是與DA1相互作用的必要元件[50]。UBP15可以被多重單泛素化的DA1切割，失去功能導(dǎo)致種子變小[11]。

水稻中OsUBP15與擬南芥AtUBP15同源，由LG1編碼，具有去泛素化酶活性。OsUBP15的功能缺失或下調(diào)導(dǎo)致籽粒變小，相較于野生型OsUBP15，突變體Osubp15增強了蛋白的穩(wěn)定性，且OsUBP15與OsDA1存在直接作用[55]。遺傳分析表明，OsUBP15和OsGW2在調(diào)節(jié)籽粒寬度和大小方面可能存在互作，OsUBP15通過影響小穗穎殼內(nèi)的細胞增殖正向調(diào)控粒寬和籽粒大小[55]。

3.3.2UBP12和UBP13基因 UBP12和UBP13在DA1、DAR1和DAR2的上游起作用，可以從這些蛋白質(zhì)中去除泛素以影響它們的蛋白酶活性，使它們處于非活性狀態(tài)，從而對植物的生長和發(fā)育起微調(diào)作用[56]。

3.3.3OTU1和OTUB1基因 組蛋白2(H2A和H2B)的單泛素化與植物生命活動密切相關(guān)。如H2B單泛素化會影響植物的生長、種子休眠、根和葉生長、晝夜節(jié)律鐘、開花時間和光形態(tài)發(fā)生等，H2B單泛素化反過來影響組蛋白3(H3)和4(H4)的甲基化和乙?；癄顟B(tài)，最終導(dǎo)致相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄抑制或激活[57]。擬南芥中OTU1(otubain樣半胱氨酸蛋白酶)為組蛋白去泛素化酶，是一種影響種子和葉片大小的核質(zhì)蛋白，在幼嫩組織中表達量較高。OTU1負調(diào)控DA1和DA2的表達，其功能缺失導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄激活；OTU1功能缺失對BB表達無顯著影響，由此表明，兩種泛素介導(dǎo)的通路可能由不同的染色質(zhì)修飾因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控[57]。

WTG1(wide and thick grain 1)編碼一種與人OTUB1同源的去泛素化酶，屬于卵巢腫瘤域蛋白酶(OTU)家族[58]。WTG1/OsOTUB1的過表達導(dǎo)致籽粒細長，且籽粒數(shù)量減少，wtg1-1突變體表現(xiàn)為寬、粗、短粒，粒重增加，穗粒數(shù)也顯著增加；WTG1/OsOTUB1主要通過影響小穗穎殼中細胞膨脹來調(diào)控種子的大小和形狀，還通過促進水稻OsSPL14(squamosa promoter binding protein-like 14)、IPA1(ideal plant architecture 1)、WFP(wealthy farmer’s panicle)的降解來調(diào)節(jié)株型[59]。WTG1/OsOTUB1限制OsSPL14 K63連接的泛素化，而促進K48連接的泛素化以調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性，也可能以下游細胞擴增調(diào)節(jié)劑為目標來調(diào)控種子大小[2]。

3.4 UPS對種子大小的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

在擬南芥中，組蛋白去泛素化酶OTU1負調(diào)控DA1和DA2的表達，其功能缺失導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄激活[57](圖2)。轉(zhuǎn)錄激活后，DA2和BB都能在多個位點單泛素化DA1，從而激活DA1的肽酶活性?；钚訢A1肽酶可以裂解多種生長調(diào)節(jié)劑來調(diào)控種子和器官的生長，如PUB15[11]。PUB15通過調(diào)節(jié)珠被中細胞增殖來促進種子生長[50]。激活的DA1還可以反向調(diào)控裂解或破壞BB和DA2的穩(wěn)定性[11]。

圖2 泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)控制種子大小Fig.2 Ubiquitin/26S proteasome system controls seed size

小麥TaGW2-6A突變通過UPS阻止目標底物的降解，并調(diào)控CK和淀粉相關(guān)基因的表達，從而間接影響籽粒的灌漿速率、淀粉積累速率和胚乳細胞大小，最終影響籽粒大小和粒重[35]。

4 展望

種子大小是影響幼苗活力和早期生長的關(guān)鍵性狀，也是決定作物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，而產(chǎn)量是關(guān)系糧食安全的重要問題[43]。種子大小是數(shù)量性狀，因此具有復(fù)雜的調(diào)控機制。對種子大小調(diào)控機制的解析任重而道遠。盡管已經(jīng)報道了多個基因、多條途徑，但大多僅限于基因功能的驗證，其上下游的互作基因及蛋白仍然有待挖掘。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是一種重要的調(diào)控機制，通過在蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈上共價結(jié)合一些小分子化學基團來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、活性、定位和蛋白質(zhì)間的互作，從而決定蛋白質(zhì)的生物學功能[60]。泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)是蛋白質(zhì)泛素化的重要途徑，作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，在作物生長發(fā)育的各個階段發(fā)揮著重要作用。目前，編碼該系統(tǒng)的目標基因被廣泛研究，但多數(shù)集中于E3s，因為E3s在該系統(tǒng)中能夠特異性的識別目標蛋白。泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)被鑒定為模式植物調(diào)控種子大小的保守途徑[1]。DA1是該調(diào)控途徑的核心成分，其作用與DAR1部分重疊[10-11]。在擬南芥、甘藍型油菜、玉米和小麥等作物中都對DA1的功能進行了驗證[11-14]。該基因在不同物種間具有相似的作用，意味著種子大小的調(diào)控機制具有一定的保守性。如水稻OsGW2的同源基因在小麥、擬南芥和玉米中被證明也具有調(diào)控籽粒大小的功能[23-25,28-40]。除已報道的基因外，仍有大量未知的E3s，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及作用機理有待進一步深入研究。因此，未來對泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)的研究仍然是一個重要的研究方向?，F(xiàn)代分子生物學特別是基因組學和生物信息學的迅猛發(fā)展將繼續(xù)推動這一進程。