三棱多糖的理化特性及生物活性研究

張 超, 施 洋, 劉 詠, 張 強, 王軍輝

(1.合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601; 2.功能性復合調味品安徽省重點實驗室,安徽 界首 236500)

三棱(RhizomaSparganii)是我國中藥界常用的一味中藥,屬于被子植物門(Angiospermae),單子葉植物綱(Monocotyledoneae),禾本目(Poales),黑三棱科(SparganiaceaeHanin)[1]。其味辛、苦,性平,具有破瘀、行氣、消積、止痛等功效,現(xiàn)已廣泛應用于心腦血管疾病、胸痹心痛、瘀血經閉、食積脹痛等病癥,同時作為抗癌藥物在醫(yī)學上也得以應用[2]。研究表明,三棱中含有有機酸、多糖、甾醇類、揮發(fā)油、黃酮類和礦物鹽等豐富的化學成分,其中多糖的含量尤為豐富,是三棱中的主要活性化學成分[3]。多糖作為一種免疫調節(jié)劑,在免疫功能的調節(jié)、癌癥的診斷與治療、抗衰老及解除機體疲勞等方面都有著重要作用[4]。目前關于三棱多糖的理化特性及活性的研究較少,僅有一些關于三棱中化學成分的提取以及中藥三棱藥理研究方面的報道[5-7]。

有文獻報道,從材料中不同部分所獲得的多糖在理化性質、活性等方面存在差異[8]。為了深入了解三棱中多糖的組成及特性,本文在課題組前期工作基礎上,采用熱水、螯合劑、1.0 、4.0 mol/L NaOH 4種溶劑從三棱根莖中依次獲得了三棱熱水提多糖(RSB)、三棱螯合劑提多糖(RSC)、三棱稀堿提多糖(RSDA)、三棱濃堿提多糖(RSCA)4種多糖組分,并進一步采用物理和化學方法檢測各多糖片段的理化特性并比較其活性差異,為三棱多糖的精細化加工及資源的開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中藥三棱(購自河北省安國同源堂)經高速藥物粉碎機粉碎,用體積分數(shù)為95%的乙醇脫色脫脂后烘干備用。其他試劑有三氯甲烷、NaCl、正丁醇、KBr、苯酚、硫酸、考馬斯亮藍G250、抗壞血酸(Vc)、FeSO4、水楊酸、ABTS、FeCl2、醋酸、DPPH試劑、二甲基亞砜、乙酸酐、吡啶、過氧化氫、EDTA-Na2等。

1.2 三棱多糖的提取

秤取100 g中藥三棱粉末,按料液比1∶30熱水提取3 h。提取液經過濾(殘渣收集)、濃縮、離心、醇沉后得到多糖沉淀。將沉淀復溶于蒸餾水中,用Sevag試劑(V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=1∶5～1∶4)脫蛋白后并以自來水透析3 d,去離子水透析2 d,將透析液凍融、離心、冷凍干燥得到RSB,多糖得率為0.5%。

熱水提殘渣用0.05 mol/L EDTA和0.05 mol/L草酸鈉溶液在pH值為5.8,100 ℃的條件下提取2 h,按照上述實驗步驟操作得到RSC,多糖得率為1.2%。

螯合劑提取殘渣在1.0 mol/L NaOH/20 mmol/L NaBH4溶液中室溫下提取2 h,用醋酸中和濾液后按照上述實驗步驟得到RSDA,多糖得率為5.7%。

1 mol/L堿提殘渣在4 mol/L NaOH/20 mmol/L NaBH4溶液中室溫下提取2 h,用醋酸中和濾液后同樣按照上述實驗方法得到RSCA,多糖得率為2.8%。

1.3 三棱多糖理化性質分析

1.3.1 化學成分測定

參照文獻[9-10],將多糖轉化成糖醇乙酸酯后進行氣相色譜(gas chromatography,GC)分析。檢測條件設定如下:N2流速為20 mL/min,H2流速為30 mL/min,空氣流速為200 mL/min,柱溫230 ℃,檢測器溫度250 ℃,氣化室溫度280 ℃。根據標準單糖的滯留時間判定多糖樣品的單糖組成,以峰面積計算各單糖的摩爾分數(shù)。

三棱多糖摩爾分數(shù)采用苯酚硫酸法測定[11],蛋白質摩爾分數(shù)采用考馬斯亮藍法檢測[12],糖醛酸摩爾分數(shù)采用咔唑法進行檢測[13]。

1.3.2 熱特性分析

稱取5 mg干燥樣品,利用熱重分析儀(thermal gravimetric analyzer,TGA)對提取的多糖樣品進行分析。設定溫度范圍為35～800 ℃,加熱速率為10 ℃/min,保護氣(N2)流量為50 mL/min,吹掃氣(O2、N2)流量為20 mL/min。

1.3.3 紅外光譜分析

稱取待測多糖樣品1 mg同溴化鉀充分研磨后,在紅外燈下加熱、壓片。將制備好的透明薄片放入傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)中掃描,掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.4 三棱多糖顯微結構測定

使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscope,FESEM)測定三棱多糖的顯微結構。將樣品處理后固定在載玻片上于5 kV電壓下觀察多糖的微觀結構。

1.4 生物活性測定

1.4.1 抗氧化活性

依據文獻所提到的方法設定不同質量濃度梯度的樣品溶液[14-16],分別測定多糖對DPPH自由基、羥基自由基以及ABTS自由基清除的能力。

1.4.2 免疫調節(jié)活性

將小鼠巨噬細胞株RAW 264.7細胞在DMEM培養(yǎng)基(含10%小牛血清,100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)中置于37 ℃,5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用DMEM培養(yǎng)液將細胞稀釋至1.0×105個/mL,取150 μL細胞液于96孔板中,貼壁培養(yǎng)24 h,加入50 μL質量濃度分別為20、50、100、200、500 μg/mL的多糖溶液,培養(yǎng)24 h后分別加入20 μL 質量濃度為5 mg/mL的MTT試劑,混勻,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,移去上清液,加入200 μL DMSO,振蕩10 min后用酶標儀在570 nm下測定吸光度值。

為測定RAW264.7細胞的NO產生量,用DMEM培養(yǎng)液將細胞稀釋至1.0×105個/mL。取150 μL細胞液于96孔板中,培養(yǎng)24 h后分別加入50 μL質量濃度分別為20、50、100、200、500 μg/mL的多糖溶液,培養(yǎng)24 h后分別取100 μL細胞上清液于96孔板中,向板中加入Griess試劑,靜置10 min后用酶標儀在540 nm下測定吸光度值。

同樣按照上述實驗方法,移除已培養(yǎng)48 h后的細胞上清液,用PBS清洗后加入100 μL中性紅染色液繼續(xù)培養(yǎng)4 h,移除多余的中性紅溶液,PBS沖洗2次,加入細胞裂解液,放置1 h后用酶標儀在540 nm下測定吸光度值。

空白對照組為DMEM培養(yǎng)基,正對照為脂多糖(LPS),每組實驗均有6個復孔。

1.5 數(shù)據處理

采用Origin 9.1軟件繪制圖表,利用SPSS 24.0軟件進行數(shù)據統(tǒng)計處理,*表示P<0.05差異顯著,**表示P<0.01差異極顯著。

2 結果分析

2.1 三棱多糖的理化特性分析

三棱多糖的化學成分分析結果見表1所列。由表1可知,4種組分的化學成分差異顯著。其中RSB、RSC、RSDA、RSCA的總碳水化合物摩爾分數(shù)分別為54.51%、70.01%、85.36%、88.44%,糖醛酸摩爾分數(shù)為5.43%、3.16%、0.59%、0.38%。與RSB和RSC相比,堿提組分中的蛋白質摩爾分數(shù)更低,其中在RSCA中未檢測到蛋白質的存在。單糖組成分析結果表明RSB與RSC中均含有阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖4種單糖,其中葡萄糖摩爾分數(shù)最高,分別為84.85%和78.89%。堿提組分RSDA中含有16.53%的甘露糖,但在RSB與RSC中未檢測到甘露糖存在,推測可能由于在堿性環(huán)境下,破壞了三棱中細胞壁結構,使得細胞壁中的甘露糖成分溶于提取液中。堿提組分(RSDA、RSCA)中未檢測到鼠李糖存在,且4種組分中均不含有半乳糖。

表1 三棱多糖化學成分及其摩爾分數(shù) 單位:%

三棱多糖的FTIR譜圖如圖1所示。

圖1 多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA的FTIR譜圖

從圖1可以看出,4種組分均有顯著的多糖結構。根據文獻資料對各樣品吸收峰進行分析[17-20],在3 400 cm-1處的吸收峰為糖環(huán)的O—H伸縮振動,2 925 cm-1處的吸收峰歸因于—CH2—基團的C—H伸縮振動,1 420～1 385 cm-1處的吸收峰歸因于C—H的變角振動,1 073 cm-1處歸因于吡喃糖環(huán)中C=O伸縮和變角振動。此外,RSB與RSC在1 740 cm-1處有明顯的吸收峰,說明這2種多糖中含有糖醛酸。

多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA在同一放大倍數(shù)下的微觀結構如圖2所示。

圖2 多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA的FESEM圖

從圖2可以看出，RSB與RSC在放大200倍條件下呈現(xiàn)出塊狀或片狀結構,而堿提組分則呈現(xiàn)出疏松的孔狀或網絡狀結構?？赡茉趬A性環(huán)境下多糖間化學鍵被破壞,其表面形態(tài)呈多孔狀網絡布局。該結構與水提組分相比更加疏松,且多糖的穩(wěn)定性更容易受到外界環(huán)境因素影響。

4種組分的熱重(thermogravimetric,TG)分析曲線如圖3所示,從圖3可看出,熱分解的第1階段主要集中在35～175 ℃,RSB、RSC、RSDA、RSCA在此階段中主要損失為多糖中的結合水以及易熱分解化合物,質量損失率依次為11.64%、11.03%、5.41%、9.03%,其中RSB分解速率最快,RSDA分解速率最慢;熱分解的第2階段為175～800 ℃,在該階段中4種多糖的化學鍵被破壞,多糖因高溫分解,RSB、RSC、RSDA、RSCA在此階段中的質量損失率依次為66.44%、68.68%、72.51%、73.45%。比較4種組分的熱重分析結果發(fā)現(xiàn)RSB與RSC質量損失速度開始減緩時的溫度要高于RSDA、RSCA組分,說明多糖RSB、RSC比堿提組分(RSDA、RSCA)的結構更穩(wěn)定。這可能是由于堿提多糖中聚合物含量較低,存在大量短鏈糖以及多側鏈糖且結構比水提組分更加疏松，從而使多糖更易受熱分解。

圖3 多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA的TG分析

2.2 三棱多糖的活性分析

2.2.1 抗氧化活性研究

三棱多糖的抗氧化活性結果如圖4所示。從圖4可以看出,4種多糖組分的抗氧化活性均呈現(xiàn)出質量濃度依賴性,且活性大小隨著多糖質量濃度增加而增大,當多糖質量濃度為5 mg/mL時自由基清除率達到最高。通過比較4種多糖的抗氧化活性結果可以看出,RSB在DPPH自由基(圖4a)、羥基自由基(圖4b)、ABTS自由基(圖4c)的清除能力上均表現(xiàn)最佳,最高自由基清除率依次可達到81.47%、80.80%、52.57%。而RSCA的抗氧化活性在4種組分中表現(xiàn)最差,最高自由基清除率依次為61.21%、63.24%、37.52%。RSDA組分在ABTS自由基的清除能力上略高于RSC組分,但在DPPH自由基與羥基自由基的活性數(shù)據上低于RSC組分。總體而言,多糖RSB、RSC與堿提組分(RSDA和RSCA)相比具有更高的抗氧化活性。推測堿性環(huán)境下多糖的結構可能被破壞,從而導致4種組分的抗氧化活性結果產生顯著差異。

圖4 多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA的抗氧化活性

2.2.2 免疫活性分析

多糖組分RSB、RSC、RSDA、RSCA的免疫調節(jié)活性結果如圖5所示。從圖5a可以看出，當多糖在不同質量濃度條件下，4種組分對巨噬細胞的增殖活性有不同的影響。其中RSDA與RSCA的細胞增殖活性呈現(xiàn)出質量濃度依賴性，增殖指數(shù)隨著質量濃度的升高而增大，當多糖質量濃度為500 μg/mL時，其對應的增殖指數(shù)達到最大值，分別為1.61、1.49。RSB與RSC對巨噬細胞增殖活性的影響呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢，當多糖質量濃度為200 μg/mL時,增殖指數(shù)達到最大值，分別為1.56、1.51。

圖5 4種多糖組分對巨噬細胞RAW264.7免疫活性的影響

從圖5b可以看出，多糖組分RSC、RSDA與RSCA的NO釋放量在實驗質量濃度范圍內呈現(xiàn)出質量濃度依賴性，隨著質量濃度的升高NO釋放量增加，當多糖質量濃度為500 μg/mL時NO釋放量達到最大值，分別為3.21、3.56、2.68。RSB的NO釋放量在各質量濃度條件下均高于其他3組，在多糖質量濃度為200 μg/mL時NO釋放量達到最大值為3.62。從圖5c可以看出，4種多糖組分均在不同程度上促進了巨噬細胞RAW264.7對中性紅的吞噬能力。RSC與RSCA對巨噬細胞吞噬活性的影響呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢，在多糖質量濃度為100 μg/mL時吞噬活性最佳，而RSB與RSDA在多糖質量濃度為200 μg/mL時表現(xiàn)出最佳的吞噬活性。

通過比較多糖組分RSB、RSC、RSDA、RSCA的免疫活性結果,發(fā)現(xiàn)堿提組分RSDA與水提組分RSB對巨噬細胞的免疫活性影響要優(yōu)于其他2種組分,其中堿提組分RSDA的效果最佳。細胞的生物活性與多糖的分子量、支化度、化學結構和鏈構象等因素有關[21]。而與水提組分相比堿提多糖中聚合物含量低,短鏈糖以及小分子多糖等化合物含量較高,由于在不同的提取條件下所獲得的多糖組分的分子量、化學成分及結構穩(wěn)定性不同,因此4種組分對巨噬細胞免疫活性的影響存在差異。

3 結 論

本實驗通過順序提取法,從中藥三棱粉末中提取出4種多糖組分RSB、RSC、RSDA、RSCA，并對其理化性質及活性進行研究。理化性質結果表明，4種多糖組分均由阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、木糖以及葡萄糖組成，其中葡萄糖為多糖RSB、RSC、RSCA的主要成分，摩爾分數(shù)分別為84.85%、78.89%、86.51%。RSB、RSC比堿提組分(RSDA和RSCA)的結構更穩(wěn)定且熱穩(wěn)定性更好。活性分析結果表明:4種多糖對DPPH自由基、羥基自由基以及ABTS自由基有清除作用，其中RSB的抗氧化活性最顯著，最高自由基清除率依次為81.47%、80.80%、52.57%；同時多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA均能有效促進巨噬細胞的免疫活性，多糖的化學成分及熱特性差異可能對活性有影響。研究結果有助于認識三棱多糖更深層次研究價值，為中藥三棱精深利用提供參考。