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    白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳汁體細(xì)胞、酶、炎性和抗氧化因子影響

    2021-09-29 03:02:38錢柏霖尤留超呂尚揆肖勁邦蘇柘僮裴淼毓左昌雄楊世林馮育林沈留紅
    關(guān)鍵詞:白頭翁乳清乳汁

    錢柏霖,尤留超,張 鉞,莘 余,呂尚揆,肖勁邦,蘇柘僮,董 可,裴淼毓,左昌雄,楊世林,馮育林*,沈留紅*

    (1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院/動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/奶牛疾病研究中心,四川 成都 611130;2.廣西英路維特藥物有限公司,廣西 荔浦 541100;3.四川育強(qiáng)本草生物技術(shù)有限公司,四川 成都 611130;4.江西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心,江西 南昌 330006)

    【研究意義】臨床型乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)危害最為嚴(yán)重的疾病之一,不僅會降低奶牛生產(chǎn)性能、泌乳量和乳品質(zhì),而且治療周期長、成本高,嚴(yán)重影響牧場效益。目前國內(nèi)外主要通過使用各種抗菌藥物防治該病,然而長期、大量反復(fù)使用抗菌藥物不僅導(dǎo)致療效下降、抗生素殘留和耐藥菌株產(chǎn)生等問題,還嚴(yán)重危害人類健康。為配合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部開展的“獸用抗菌藥使用減量化行動”,探尋天然高效、無耐藥性和乳汁殘留的抗生素替代藥物極具研究價(jià)值,對奶牛養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】奶牛發(fā)生乳房炎時,致炎因素刺激機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)等炎癥介質(zhì)[1],損傷乳腺細(xì)胞并導(dǎo)致血管擴(kuò)張,促使血液中白細(xì)胞進(jìn)入乳汁,引起體細(xì)胞數(shù)(somatic cell counts,SCC)升高并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[2]。在體細(xì)胞溶酶體酶作用下,乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-d-glucosaminidase,NAG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,AST)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)等活性改變[3-4]。同時,炎癥反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體氧化-抗氧化失衡,使總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)等抗氧化指標(biāo)水平降低,丙二醛(malonaldehyde,MDA)堆積,造成乳腺氧化損傷[5]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】白頭翁及其提取物皂苷B4 可明顯抑制金黃色葡萄球菌和傷寒沙門氏菌等[6],下調(diào)IL-1β、IL-6和TNF-α水平,抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[7],提高機(jī)體抗氧化和抗凋亡功能[8],增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答[9],兼具藥物和營養(yǎng)劑雙重作用,高效低毒且不易產(chǎn)生耐藥性和乳汁殘留,在替代抗生素治療乳房方面極具潛力和研究價(jià)值,且其治療臨床型乳房炎奶牛療效顯著[10]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)旨在探究白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳汁SCC,乳清酶LDH、NAG、ALT、AST、ALP、ACP,炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 和抗氧化因子T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT、MDA的影響,為其防治奶牛臨床型乳房炎提供數(shù)據(jù)支持,并為其臨床推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動物

    選用規(guī)?;敕忾]統(tǒng)一舍飼,2~3胎次泌乳高峰期、泌乳天數(shù)、產(chǎn)奶量相近的臨床檢查健康和臨床型乳房炎中國荷斯坦奶牛各12頭,自由飲水,統(tǒng)一全混合日糧飼喂,試驗(yàn)期間均無其他疾病發(fā)生,試驗(yàn)前后也未接受抗生素治療。

    1.2 主要儀器與試劑

    1.2.1 主要儀器 體細(xì)胞檢測儀,De Laval,瑞士;臺式離心機(jī),TGLB-16G,Sigma;超低溫冰箱,DW-86L828W,海爾;超凈工作臺,SW-CJ-1F,蘇凈集團(tuán);全波長酶標(biāo)儀,Varioskan Flash,美國;紫外可見分光光度計(jì),Lambda 45,美國;電子恒溫水浴鍋,DZKW-4,北京中興;微量加樣器,LH99186,美國Thermo。

    1.2.2 主要試劑 白頭翁皂苷B4 注射液(100 mL/瓶,白頭翁皂苷B4 含量66.00%),PubChem CID:11636713,由英路維特醫(yī)藥科技有限公司惠贈,經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心鑒定。

    乳酶LDH、NAG、ALT、AST、ALP、ACP,炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α,抗氧化因子T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT、MDA雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒,上海酶聯(lián)生物。

    1.3 方法

    1.3.1 臨床型乳房炎奶牛判斷標(biāo)準(zhǔn) 試驗(yàn)?zāi)膛>鶠樽匀桓腥?,由牧場同一?zhí)業(yè)獸醫(yī)判定,表現(xiàn)典型臨床體征,入選標(biāo)準(zhǔn)如下:感染乳區(qū)乳汁SCC>50 萬/mL,患區(qū)紅、腫,觸之敏感、不安、躲避等,體溫升高,乳腺腫大,泌乳量顯著減少或停止,乳汁異常,呈淺黃色或淺紅色,稀薄、粘稠或有絮狀物[11-12]。

    1.3.2 分組和給藥 12 頭健康奶牛記為對照組(不注射藥物),12 頭臨床型乳房炎奶牛記為試驗(yàn)組(按0.05 mL/kg頸部肌肉注射白頭翁皂苷B4,1 次/d,連續(xù)6 d),乳房炎發(fā)病當(dāng)天記為第0天,觀察臨床療效至第12天。

    1.3.3 乳清采集和保存 每日08:00 于用藥前分別采集各組奶牛第0、1、3、5、7、9、11 天乳汁。采樣前溫水清洗乳房,75%酒精消毒,棄去前3 把后采集10 mL 乳汁,5 mL 立即檢測SCC,5 mL 在4 ℃下10 000 r/min 離心2次,30 min/次,充分脫脂,直至透明清亮,取上層乳清,-80 ℃凍存。

    1.3.4 體細(xì)胞數(shù)和乳清因子檢測 分別采用De Laval 乳汁體細(xì)胞檢測儀和ELISA 法檢測試驗(yàn)?zāi)膛5?、1、3、5、7、9、11 天乳汁SCC 和乳清酶LDH、NAG、AST、ALT、ALP、ACP,炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNFα,抗氧化因子T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT、MDA含量。

    1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

    采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,K-S檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布,各計(jì)量資料數(shù)據(jù)均采用平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±Standard Deviation)表示,組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05為差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳汁體細(xì)胞數(shù)的影響

    如表1所示,試驗(yàn)組臨床型乳房炎奶牛乳汁SCC在0~7 d顯著高于對照組(P<0.05),隨用藥時間推移呈下降趨勢,在0~7 d 顯著下降(P<0.05),7~11 d 無顯著變化(P>0.05),并在9、11 d 與對照組差異不顯著(P>0.05),表明白頭翁皂苷B4可顯著降低臨床型乳房炎奶牛乳汁SCC。

    表1 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳汁體細(xì)胞數(shù)的影響Tab.1 The effect of Pulsatilla saponin B4 on somatic cell count of milk in dairy cows with clinical mastitis

    2.2 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳清酶的影響

    如表2 所示,臨床型乳房炎奶牛乳清LDH 和NAG 在0~3 d 顯著高于對照組(P<0.05),AST 和ACP 在0~5 d 顯著高于對照組(P<0.05),ALT 在0~7 d 顯著高于對照組(P<0.05),ALP 在0~11 d 顯著高于對照組(P<0.05),隨用藥時間推移,各指標(biāo)均呈下降趨勢;其中LDH和NAG在5~11 d與對照組差異不顯著(P>0.05),AST和ACP在7~11 d與對照組差異不顯著(P>0.05),ALT在9~11 d與對照組差異不顯著(P>0.05),ALP 在用藥后仍顯著高于對照組(P<0.05),但其含量顯著低于發(fā)病初(P<0.05),表明白頭翁皂苷B4可顯著促進(jìn)臨床型乳房炎奶牛乳酶恢復(fù)至健康水平。

    表2 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳清酶的影響Tab.2 The effect of Pulsatilla saponin B4 on enzymes activity of whey in dairy cows with clinical mastitis

    2.3 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳清炎性因子的影響

    如表3 所示,試驗(yàn)組臨床型乳房炎奶牛乳清IL-1β 在0~5 d 顯著高于對照組(P<0.05),IL-6、IL-8 和TNF-α 在0~7 d 顯著高于對照組(P<0.05),隨用藥時間推移,各指標(biāo)均呈下降趨勢;其中IL-1β 在7~11 d與對照組差異不顯著(P>0.05),IL-6、IL-8 和TNF-α 在9~11 d 與對照組差異不顯著(P>0.05),表明白頭翁皂苷B4可顯著降低臨床型乳房炎奶牛乳清炎性因子含量。

    表3 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳清炎性因子的影響Tab.3 The effect of Pulsatilla saponin B4 on inflammatory factors of whey in dairy cows with clinical mastitis

    2.4 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳清抗氧化因子的影響

    如表4 所示,臨床型乳房炎奶牛乳清T-AOC 和GSH-Px 在0~5 d 顯著低于對照組(P<0.05),CAT 和SOD 分別在0~3 d 和0~1 d 顯著低于對照組(P<0.05),隨用藥時間推移,各指標(biāo)均呈上升趨勢,其中TAOC 和GSH-Px 在7~11 d 與對照組差異不顯著(P>0.05),CAT 和SOD 分別在5~11 d 和3~11 d 與對照組差異不顯著(P>0.05);MDA 含量在0~1 d 顯著高于對照組(P<0.05),隨用藥時間推移,呈下降趨勢,在3~11 d 與對照組差異不顯著(P>0.05),表明白頭翁皂苷B4 可顯著升高臨床型乳房炎奶牛乳清抗氧化因子含量,降低脂質(zhì)過氧化物含量。

    表4 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳清抗氧能力的影響Tab.4 The effect of Pulsatilla saponins B4 on antioxidant index of whey in dairy cows with clinical mastitis

    3 討論與結(jié)論

    3.1 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳汁體細(xì)胞和炎性因子的影響

    奶牛乳汁SCC是指每毫升原乳含有的細(xì)胞總數(shù),主要包括巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞以及脫落的乳腺上皮細(xì)胞等,它們共同參與乳房細(xì)胞免疫,其含量隨乳房炎嚴(yán)重程度增加而升高,可作為奶牛臨床型乳房炎早期診斷和療效評估指標(biāo)[13]。當(dāng)奶牛發(fā)生乳房炎時,病原微生物刺激并激活其合成和分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子參與炎癥反應(yīng),而炎性因子通過趨化作用,又吸引免疫細(xì)胞向炎癥部位聚集,最終造成乳腺炎癥相關(guān)因子過度表達(dá),導(dǎo)致乳腺細(xì)胞損傷加劇[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,臨床型乳房炎奶牛乳汁SCC 和炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 含量顯著高于健康奶牛(P<0.05),與資料報(bào)道一致[15],可能是細(xì)菌感染損傷乳腺組織,使血管增強(qiáng)通透性,血液白細(xì)胞進(jìn)入乳中,導(dǎo)致SCC 升高并產(chǎn)生大量的炎性因子引起炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)中藥可有效提高機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫功能,減輕泌乳期奶牛炎癥反應(yīng),降低乳汁SCC,提高奶牛生產(chǎn)性能和乳品質(zhì)[16-17]。白頭翁皂苷B4具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[18],可顯著降低中性粒細(xì)胞數(shù)量[19],通過抑制炎癥信號通路中相關(guān)蛋白表達(dá),下調(diào)炎性因子含量,發(fā)揮抗炎作用[20]。本試驗(yàn)中,臨床型乳房炎奶牛經(jīng)白頭翁皂苷B4治療后,乳汁SCC、IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 含量顯著降低(P<0.05),并最終接近正常水平,與上述學(xué)者研究結(jié)果一致,說明白頭翁皂苷B4具有顯著抗炎效果,通過降低促炎因子含量,減輕乳腺炎癥反應(yīng),從而促進(jìn)乳房恢復(fù)健康,而炎性因子的減少又抑制巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向乳腺損傷部位趨化和募集,降低乳汁SCC,形成良性循環(huán),最終恢復(fù)至健康水平。

    3.2 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳酶的影響

    奶牛乳酶參與乳汁產(chǎn)生和分泌,在乳腺先天性免疫和抗氧化過程中發(fā)揮重要作用,但當(dāng)奶牛發(fā)生乳房炎時,其活性顯著變化,因此乳酶活性對診斷奶牛乳房炎具有重要意義。其中LDH 和NAG 含量在乳房炎奶牛乳汁中顯著升高,反映白細(xì)胞聚集過程和乳腺組織損害程度,可作為乳房炎早期診斷指標(biāo)[4,21],乳房炎牛乳中ALP 和ACP 含量隨乳房炎嚴(yán)重程度增加而升高[22],而AST 和ALT 在一定程度上可判斷乳腺損傷和炎癥感染程度[23]。本試驗(yàn)中,臨床型乳房炎奶牛乳清NAG、LDH、AST、ALT、ALP 和ACP 含量均顯著高于健康奶牛(P>0.05),與上述研究結(jié)果一致,乳房炎導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞和血乳屏障受損,血液中酶直接進(jìn)入乳中,同時體細(xì)胞中大量溶酶體發(fā)生溶解,進(jìn)一步使乳中酶活性升高。而使用白頭翁皂苷B4 治療后,臨床型乳房炎奶牛乳清NAG、LDH、AST、ALT 和ACP 含量均呈下降趨勢,并最終基本恢復(fù)至健康水平,與于文會等[24]和覃杰等[25]研究結(jié)果一致,白頭翁皂苷B4 修復(fù)受損血管內(nèi)皮細(xì)胞并增強(qiáng)中性粒細(xì)胞殺菌能力,抑制血液體細(xì)胞和溶酶體向乳汁轉(zhuǎn)移[26],并增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[27],促使奶牛乳酶恢復(fù)正常水平。

    3.3 白頭翁皂苷B4對臨床型乳房炎奶牛乳清抗氧化能力的影響

    炎癥發(fā)展過程中,免疫細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除病原體,機(jī)體耗氧量增加并產(chǎn)生過量超氧陰離子(superoxide anion,)。當(dāng)抗氧化能力不足以清除時,細(xì)胞發(fā)生氧化變化并誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化,從而損害奶牛乳腺組織[28]。反映機(jī)體抗氧化功能指標(biāo)主要有T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT和MDA 等,其中T-AOC 是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo),可判斷機(jī)體氧化應(yīng)激程度[29]。GSH-Px是重要的脂質(zhì)過氧化物分解酶,可衡量機(jī)體抗氧化能力[30]。SOD和CAT可通過清除和過氧化氫等強(qiáng)氧化性物質(zhì),減緩氧自由基對細(xì)胞氧化損傷[31]。MDA 則是機(jī)體脂質(zhì)受氧自由基攻擊損害程度的重要指標(biāo)之一[32]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,臨床型乳房炎奶牛乳清T-AOC、GSH-Px、SOD 和CAT含量顯著低于健康奶牛(P<0.05),MDA 顯著高于對照組(P<0.05),與尹柏雙等[33]研究結(jié)果一致,可能是機(jī)體為對抗炎癥反應(yīng),不斷產(chǎn)生和過氧化氫殺滅病原菌,但氧自由基過多引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng),使抗氧化酶活性降低,造成組織細(xì)胞損傷,最終導(dǎo)致奶牛氧化-抗氧化失衡。研究表明白頭翁、秦皮和杜仲混合提取物可提高麻鴨免疫功能和抗氧化能力[34]。白頭翁及皂苷B4可提高T-AOC和SOD含量,降低MDA含量[35-36]。本試驗(yàn)中,白頭翁皂苷B4 提高了臨床型乳房炎奶牛乳清T-AOC、GSH-Px、SOD 和CAT 含量,降低MDA 含量,與He等[8]研究結(jié)果一致,可能是白頭翁皂苷B4促進(jìn)奶牛機(jī)體T-AOC 和SOD 將過多的轉(zhuǎn)換為過氧化氫,并在GSH-Px 和CAT 作用下生成水和氧氣,從而減輕機(jī)體和MDA 堆積,避免細(xì)胞受損,恢復(fù)抗氧化功能[37]。

    白頭翁皂苷B4可顯著降低臨床型乳房炎奶牛炎癥反應(yīng)和乳汁SCC,促進(jìn)乳酶恢復(fù)正常水平,增強(qiáng)乳腺抗氧化能力,是治療奶牛臨床型乳房炎的理想藥物。

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