柿脫澀過程中褐變及相關(guān)酶活性的變化規(guī)律

韓衛(wèi)娟，曹 坤，傅建敏，王藝儒，張嘉嘉，李樹戰(zhàn)

(1 國家林業(yè)和草原局泡桐研究開發(fā)中心 經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450003；2 中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

柿(DiospyroskakiThunb.)為柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros)植物，是我國重要的六大木本糧油樹種之一，果實(shí)色澤鮮艷，風(fēng)味甜美，營養(yǎng)豐富，具有重要的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)價(jià)值[1]。據(jù)2018年聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，我國柿栽培面積約98.15萬hm2，年產(chǎn)量達(dá)421.64萬t，均居世界之首，分別占世界的91.32%和73.32%。然而除大別山區(qū)有極少量的完全甜柿外，我國其他柿資源均為完全澀柿類型，暫未發(fā)現(xiàn)不完全甜柿和不完全澀柿類型[2]。澀柿果實(shí)硬熟期可溶性單寧含量仍高于可食用閾值2 mg/g[3]，須人工脫澀后方可食用。

傳統(tǒng)的脫澀方法主要是通過促進(jìn)果實(shí)的后熟過程來達(dá)到脫澀效果，只有果實(shí)變軟后其澀味才能降至可食用程度，不僅脫澀周期長(zhǎng)而且果實(shí)變軟后極不耐貯運(yùn)，嚴(yán)重降低了鮮食柿果實(shí)的商品價(jià)值，進(jìn)而導(dǎo)致柿資源大量浪費(fèi)[3]。因此，需要在柿果實(shí)成熟后進(jìn)行快速人工脫澀，并保持果實(shí)硬度。目前脫澀保硬的方法主要有N2脫澀、CO2脫澀、溫水脫澀等，其中CO2脫澀技術(shù)最為成熟，可大規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用于鮮食柿產(chǎn)業(yè)[4-5]。日本成功運(yùn)用該技術(shù)對(duì)‘平核無’和‘刀根早生’2個(gè)澀柿品種進(jìn)行了大規(guī)模脫澀；但是，我國多數(shù)主栽澀柿品種在CO2脫澀過程中均出現(xiàn)不同程度的褐變現(xiàn)象[6-7]。前期研究表明，可溶性固形物含量越高、風(fēng)味越香甜的澀柿品種，越容易發(fā)生褐變[7]，如‘磨盤柿’、‘八月黃’、‘火晶’、‘中柿1號(hào)’、‘恭城月柿’等國內(nèi)優(yōu)良品種，在脫澀過程中褐變現(xiàn)象嚴(yán)重，嚴(yán)重限制了CO2脫澀技術(shù)在我國的推廣，成為制約我國鮮食澀柿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。

褐變是影響果蔬采后外觀品質(zhì)最為突出的問題之一，尤其是對(duì)顏色較淺的果蔬影響更為顯著[8]，主要表現(xiàn)為果蔬原有顏色變暗或變?yōu)楹稚玔9]，這在蘋果、梨、菠蘿、荔枝和柿等水果中均有報(bào)道[9-13]，極大地影響了果蔬的商品價(jià)值。褐變按其發(fā)生機(jī)制主要分為酶促褐變和非酶促褐變，現(xiàn)在普遍認(rèn)為水果的組織褐變是酚類物質(zhì)酶促氧化的結(jié)果[10]。果實(shí)發(fā)生酶促褐變有三大先決條件：褐變底物(酚類化合物)、多酚氧化酶和O2[14]。柿果實(shí)褐變的研究主要集中在果實(shí)鮮切加工、機(jī)械損傷以及熱水處理[13]方面，有關(guān)CO2脫澀處理引起柿果實(shí)褐變的原因尚未見系統(tǒng)報(bào)道。

本研究以極易褐變種質(zhì)‘中柿1號(hào)’為試驗(yàn)材料，通過測(cè)定不同褐變等級(jí)果實(shí)的硬度，單寧、總酚、黃酮、抗壞血酸和丙二醛(MDA)含量以及多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等褐變相關(guān)酶活性，探討CO2脫澀處理對(duì)柿果實(shí)生理生化品質(zhì)的影響，以期揭示澀柿果實(shí)CO2脫澀過程中褐變發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制，為促進(jìn)柿產(chǎn)業(yè)健康快速發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以國家林業(yè)和草原局泡桐研究開發(fā)中心選育的極易褐變柿品種‘中柿1號(hào)’的果實(shí)為試驗(yàn)材料。2018年10月于果實(shí)商熟期在國家林業(yè)和草原局泡桐研究開發(fā)中心孟州試驗(yàn)基地(112°42′58″ E，34°51′38″ N)，選擇6株樹勢(shì)健壯、無病蟲害的無性系單株從東南西北4個(gè)方向進(jìn)行樣品采集，每株采集20個(gè)果實(shí)低溫冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 樣品處理

挑選100個(gè)大小均一、顏色均勻、無病蟲害的果實(shí)，隨機(jī)分為2組，即對(duì)照組和CO2脫澀組。(1)對(duì)照組。果實(shí)于25 ℃、相對(duì)濕度90%條件下放置48 h；(2)CO2脫澀組。參照孫鵬等[3]的方法，將果實(shí)裝入由厚度60 μm塑料膜制成的塑料袋內(nèi)，通過連接膠管將純度為99.999 9%食品級(jí)CO2充入塑料袋內(nèi)，將管口伸入塑料袋底部，持續(xù)充入CO2直到封口處排出的氣體能迅速熄滅火焰，然后再持續(xù)充入20 s, 之后迅速封閉袋口；25 ℃、相對(duì)濕度90%條件下脫澀處理24 h，打開袋口，將果實(shí)自然暴露于大氣中，同條件下繼續(xù)脫澀24 h。脫澀后的果實(shí)根據(jù)褐變面積分為3個(gè)等級(jí)：T1.褐變面積25%～49%；T2.褐變面積50%～75%；T3.褐變面積≥75%。對(duì)照組果實(shí)視為未褐變對(duì)照(CK)，CK、T1、T2和T3均隨機(jī)取10個(gè)果實(shí)，測(cè)定果實(shí)硬度和色澤后，將果肉切碎經(jīng)液氮速凍于-80 ℃保存，用于生理生化指標(biāo)及酶活性分析。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生理生化指標(biāo) 可溶性單寧和不溶性單寧含量測(cè)定參考余軒[15]的Folin-Ciocalteu法，以單寧酸為標(biāo)準(zhǔn)品，725 nm處測(cè)定吸光度，總單寧含量為可溶性單寧含量和不溶性單寧含量之和；果實(shí)硬度和果皮顏色分別采用果實(shí)硬度計(jì)(LX-A，上海倫捷)和CR-400(Konica Minolta，日本)色差儀進(jìn)行測(cè)定；丙二醛含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[16]；總酚含量測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法[17]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，765 nm處測(cè)定吸光度，樣品中總酚含量以沒食子酸計(jì)；抗壞血酸含量按照張嘉嘉等[18]的方法測(cè)定，采用30 g/L偏磷酸及體積分?jǐn)?shù)8%的冰醋酸研磨提取，0.22 μm微孔濾膜抽濾后進(jìn)行色譜分析；總黃酮含量測(cè)定采用AlCl3-(HAc-NaAc)法[17]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，400 nm處測(cè)定吸光度，樣品中總黃酮含量以蘆丁計(jì)。

1.3.2 酶活性 多酚氧化酶(PPO)活性測(cè)定采用鄰苯二酚法[19]，以每克果肉每分鐘吸光度變化值增加1為1個(gè)酶活性單位(U)。超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)比色法[19]，以每克果肉每分鐘反應(yīng)體系對(duì)NBT光化還原的抑制達(dá)50%時(shí)為1個(gè)SOD酶活性單位(U)。過氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[20]，以每克果肉每分鐘吸光度值增加1為1個(gè)POD酶活性單位(U)。過氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定采用Duan[21]的方法，以每克樣品每分鐘吸光度變化值減少0.01為1個(gè)CAT酶活性單位(U)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel軟件計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、線性回歸方程等；利用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析、Duncan’s多重比較(P<0.05水平)、Pearson相關(guān)性分析；采用Origin 2018制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 柿脫澀過程中褐變與單寧含量的關(guān)系

‘中柿1號(hào)’果實(shí)脫澀處理后3個(gè)褐變等級(jí)T1、T2、T3及對(duì)照的果實(shí)外觀見圖1。褐變前后可溶性單寧與不溶性單寧含量變化如圖2所示。

圖1 ‘中柿1號(hào)’對(duì)照(CK)與不同褐變程度果實(shí)(T1、T2和T3)的外觀Fig.1 Control (CK) and different browning grades (T1,T2 and T3) of ‘Zhongshi No.1’ fruit

同一指標(biāo)上標(biāo)不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。下同Different letters indicate significant differences at P<0.05.The same below圖2 柿果CO2脫澀褐變過程中單寧含量的變化規(guī)律Fig.2 Changes of tannin content in browning process after CO2 deastringency treatment of persimmon fruit

由圖2可知，CO2脫澀處理后，果實(shí)可溶性單寧含量顯著下降，從(14.31±0.06) mg/g(CK)降至(1.19±0.02) mg/g(T1)，低于可食用閾值2 mg/g[3]，達(dá)到可食用水平，說明CO2脫澀法能夠有效脫除柿果的澀味。CK、T1、T2、T3柿果實(shí)中不溶性單寧含量差異顯著(P<0.05)，分別為(1.64±0.13)，(9.22±0.21)，(7.47±0.19)，(9.84±0.25)mg/g，表明隨著可溶性單寧含量的逐漸下降，不溶性單寧含量不斷升高，這可能是由于高CO2低O2環(huán)境迫使果實(shí)進(jìn)行無氧呼吸產(chǎn)生乙醇，乙醇又進(jìn)一步氧化產(chǎn)生乙醛，誘導(dǎo)果實(shí)中的可溶性單寧轉(zhuǎn)化為不溶性單寧[22]，導(dǎo)致可溶性單寧含量下降，不溶性單寧含量上升。CK、T1、T2、T3柿果實(shí)中總單寧含量分別為(15.88±0.03)，(10.41±0.23)，(9.40±0.30)和(11.44±0.41) mg/g，可以看出果實(shí)褐變總單寧含量逐漸減少，這可能是單寧作為底物參與了褐變反應(yīng)引起的[23]。

2.2 褐變對(duì)澀柿果實(shí)硬度、色澤的影響

‘中柿1號(hào)’果實(shí)脫澀過程中硬度和色澤的變化如表1所示。由表1可知，果實(shí)褐變后硬度顯著下降(P<0.05)，CK、T1、T2、T3柿果實(shí)硬度分別為24.11， 5.77， 2.64和0.38 N；與CK相比，T1果實(shí)硬度急劇下降，表明褐變現(xiàn)象對(duì)果實(shí)硬度影響顯著；從T1到T3，果實(shí)硬度逐漸降低，說明褐變?cè)絿?yán)重對(duì)果實(shí)硬度的影響越大。果皮色澤是反映果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)，從表1可以看出，柿果褐變過程中，其明亮度L*值、色相a*和b*值均呈顯著下降趨勢(shì)，其中T1果實(shí)果皮色澤變化最大，說明褐變現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致柿果實(shí)色澤變暗，且褐變程度越嚴(yán)重，色澤越深。

表1 柿果CO2脫澀褐變過程中硬度、L*、a*和b*值的變化規(guī)律Table 1 Changes of firmness,L*,a* and b* in browning process after CO2 deastringency treatment of persimmon fruit

2.3 柿果脫澀過程中丙二醛、總酚含量及PPO活性的變化

由圖3-A可見，與CK相比，T1、T2和T3柿果實(shí)MDA含量顯著上升，其中T3果實(shí)MDA含量升至7.26 nmol/g，說明脫澀處理的低O2環(huán)境引起柿果實(shí)組織細(xì)胞代謝失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)區(qū)域性分布受到破壞。柿果實(shí)褐變后其總酚含量顯著下降(圖3-B)，且隨著褐變程度加劇總酚含量呈持續(xù)下降的變化趨勢(shì)，CK、T1、T2、T3柿果實(shí)總酚含量分別為13.19， 7.25， 4.76和0.98 mg/g，不同褐變等級(jí)間均有顯著性差異，說明褐變對(duì)‘中柿1號(hào)’柿果肉組織的總酚含量影響顯著。CO2脫澀處理后，多酚氧化酶(PPO)活性先顯著上升，從3.77 U/g(CK)升至22.22 U/g(T1)，活性增強(qiáng)約6倍；隨著果實(shí)褐變程度加重，PPO酶活性呈逐漸下降的變化趨勢(shì)，T3果實(shí)降至2.82 U/g，顯著低于CK(圖3-B)。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).The same below圖3 柿果CO2脫澀褐變過程中MDA含量(A)、總酚含量和PPO活性(B)的變化規(guī)律Fig.3 Changes of MDA content (A) and total phenolics content and PPO activity (B) in browning process after CO2 deastringency treatment of persimmon fruit

2.4 柿果脫澀褐變與生理生化指標(biāo)和酶活性的關(guān)系

如圖4-A所示，CK、T1、T2、T3柿果實(shí)抗壞血酸含量分別為(7.38±0.08)，(14.31±0.06)，(10.48±0.03)和(10.67±0.01) mg/hg，與總黃酮含量變化趨勢(shì)一致，均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。由圖4-B可知，褐變發(fā)生后柿果實(shí)SOD、POD、CAT活性急劇上升(P<0.05)，T1時(shí)達(dá)到最大值，分別為6.14， 22.95， 53.00 U/g；但隨著果實(shí)褐變程度加劇，SOD、POD、CAT活性逐漸降低，但均顯著高于CK。上述研究結(jié)果表明，黃酮和抗壞血酸作為非酶抗氧化系統(tǒng)，SOD、POD、CAT等作為酶類抗氧化系統(tǒng),均起到了清除活性氧、維持果實(shí)內(nèi)部氧化還原平衡狀態(tài)的作用，因此在果實(shí)褐變初期呈現(xiàn)急劇上升趨勢(shì)；但隨著低O2脅迫的持續(xù)，自身抗氧化系統(tǒng)不足以抵抗低O2脅迫，進(jìn)而導(dǎo)致果實(shí)褐變程度加劇。

圖4 柿CO2脫澀褐變過程中抗氧化指標(biāo)的變化規(guī)律Fig.4 Changes of ascorbic acid and total flavonoids contents (A) and SOD,POD and CAT enzyme activities (B) in browning after CO2 deastringency treatment of persimmon fruit

2.5 柿果脫澀前后生理生化指標(biāo)與酶活性的相關(guān)性

‘中柿1號(hào)’果實(shí)脫澀前后生理生化指標(biāo)與酶活性的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果如表2所示。

表2 ‘中柿1號(hào)’脫澀前后果實(shí)生理生化指標(biāo)與酶活性的Pearson相關(guān)性分析Table 2 Pearson correlation coefficients of physiological and biochemical indexes and enzyme activity before and after deastringency of ‘Zhongshi No.1’ fruit

由表2可知，果實(shí)硬度與可溶性單寧含量、L*、a*、b*值呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系，說明伴隨著果實(shí)色澤的改變果實(shí)硬度也在變化，且與可溶性單寧含量在褐變過程中的變化有關(guān)；可溶性單寧含量與不溶性單寧含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步說明CO2脫澀能誘導(dǎo)果實(shí)中的可溶性單寧轉(zhuǎn)化為不溶性單寧；L*、b*值與可溶性單寧含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，a*值與總酚含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，L*值與不溶性單寧含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明褐變后果實(shí)色澤變化與可溶性單寧、不溶性單寧及總酚含量的變化相關(guān)，這可能與酚類物質(zhì)作為酶促褐變的反應(yīng)底物，被氧化后聚合成褐色物質(zhì)有關(guān)[24]；抗壞血酸含量與POD、CAT活性之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，說明果實(shí)褐變發(fā)生后，抗壞血酸、POD和CAT能協(xié)同清除活性氧等有害物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

本研究表明，CO2脫澀處理后柿果實(shí)可溶性單寧含量迅速降至可食用閾值以下，達(dá)到可食用水平，說明CO2脫澀法能有效、快速脫除柿果實(shí)的澀味。可溶性單寧含量下降伴隨著不溶性單寧含量升高，這可能是由于高CO2低O2環(huán)境迫使果實(shí)進(jìn)行無氧呼吸產(chǎn)生乙醇，乙醇進(jìn)一步氧化產(chǎn)生乙醛，進(jìn)而誘導(dǎo)果實(shí)中的可溶性單寧轉(zhuǎn)化為不溶性單寧[22]。此外，果實(shí)硬度和色澤是衡量果實(shí)成熟和貯藏品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[25]，‘中柿1號(hào)’柿果實(shí)褐變發(fā)生后，硬度、色澤值均顯著下降，且褐變?cè)絿?yán)重，果實(shí)硬度值越小、色澤越暗。果實(shí)硬度、L*、b*值均與可溶性單寧含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明單寧含量的變化可能是引起柿果實(shí)CO2脫澀過程中褐變的因素之一。

當(dāng)柿果實(shí)暴露于高CO2低O2環(huán)境中時(shí)，低O2環(huán)境會(huì)誘發(fā)果實(shí)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致果肉組織活性氧水平上升，影響細(xì)胞的正常代謝，進(jìn)而導(dǎo)致生理失調(diào)，引起果實(shí)褐變[26]。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其積累水平可作為組織細(xì)胞受傷害和生理衰老褐變的重要指標(biāo)[27]。酚類物質(zhì)是酶促褐變的反應(yīng)底物，PPO是催化褐變反應(yīng)的關(guān)鍵酶[28]。本研究表明，脫澀處理后的‘中柿1號(hào)’果實(shí)MDA含量顯著上升，說明高CO2低O2環(huán)境引起柿果實(shí)組織細(xì)胞的代謝失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的區(qū)域性分布受到破壞；果實(shí)褐變后總酚、總單寧含量快速下降，PPO活性急劇上升，之后隨著果實(shí)褐變程度加重又逐漸下降，表明高CO2低O2環(huán)境增加了酚類化合物與PPO的接觸機(jī)會(huì)，導(dǎo)致酚類物質(zhì)氧化，進(jìn)而引起果實(shí)褐變。隨著果實(shí)褐變程度加劇，底物逐漸被消耗，PPO活性也逐漸降低。對(duì)荔枝采后貯藏過程的研究發(fā)現(xiàn)，隨著果實(shí)褐變，總酚含量明顯下降[21]；寇莉蘋等[23]對(duì)富士蘋果貯藏期間果肉褐變發(fā)生的生化特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，隨著褐變程度加重，單寧含量下降速度加快；何瑛等[29]發(fā)現(xiàn)石榴皮褐變底物為單寧；陶月良等[30]也發(fā)現(xiàn)栗子種子褐變底物為單寧；Larrigaudiere等[31]研究表明，梨果實(shí)出現(xiàn)輕微褐變時(shí)，PPO活性增高，隨著褐變等級(jí)加深，PPO活性降低至起始水平，這些研究結(jié)果均與本研究結(jié)果一致。