五味子木脂素舒張大鼠離體氣管平滑肌的功能研究

陳麗華，許智瑩，林程程，孫靖輝，李 賀，陳建光，王春梅

(北華大學 a 北華大學學報編輯部，b 北華大學藥學院，吉林 吉林 132013)

五味子(Schisandrachinensis(Turcz) Baill) 為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實，習稱“北五味子”，是吉林省道地藥材，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品[1]。五味子在傳統(tǒng)中醫(yī)學中是止咳平喘的重要藥物，早在漢代，張仲景在《金匱要略》記載的方劑中，均以五味子收斂肺氣而止咳，多將其加入辛溫、辛熱之品為主藥的溫肺化飲方劑之中,用于治療寒飲咳喘，如治寒飲郁肺哮喘的射干麻黃湯、里飲挾熱咳喘的厚樸麻黃湯、外寒里飲咳喘的小青龍湯、里飲射肺咳喘的苓甘五味姜辛湯等[2]。在現(xiàn)代中醫(yī)藥中，五味子用于治療呼吸系統(tǒng)疾病也成為大家關注的重點。王佳然等[3]運用數(shù)據(jù)挖掘技術，對《中國方劑數(shù)據(jù)庫》中有關五味子的方劑進行了系統(tǒng)整理，篩選出631個有關五味子的方劑，其中尤以治療肺系病癥居多，出現(xiàn)頻率高達55.09%。夏瑜楨等[4]通過檢索《中醫(yī)方劑大辭典》、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫等，對古今中醫(yī)藥治療哮喘藥的分布規(guī)律進行了研究，發(fā)現(xiàn)五味子在古今用藥中排名均在前10位，是古今醫(yī)家治療哮喘時共同選擇的核心藥物，由此可見五味子在傳統(tǒng)和現(xiàn)代醫(yī)學治療哮喘中的重要地位。

然而，現(xiàn)代藥理學有關五味子治療肺系疾病的基礎研究較少，其發(fā)揮平喘作用的物質(zhì)基礎及作用機制尚不清楚。為此，本研究采用離體氣管環(huán)灌流試驗，觀察五味子木脂素6種代表性單體成分對大鼠離體氣管平滑肌張力的影響，并初步探討五味子醇甲舒張氣管平滑肌的作用機制，以探究五味子發(fā)揮平喘作用的物質(zhì)基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物 Wistar健康雄性大鼠40只，體質(zhì)量250～300 g/只，購自長春億斯實驗動物技術有限責任公司，動物合格證號為SCXK(吉)2015-0005。將大鼠分籠飼養(yǎng)于SPF級實驗室，自由飲水進食，每天更換1次墊料，適應性喂養(yǎng)3 d后用于試驗。

1.1.2 試 劑 五味子醇甲(schisandrol A)、五味子醇乙(schisandrol B)、五味子甲素(schisandrin A)、五味子乙素(schisandrin B)、五味子丙素(schisandrin C)和五味子酯甲(schisantherin A)，均購于成都普菲德物技術有限公司，純度≥98%；普萘洛爾(propranolol)和維拉帕米(verapamil)，購自美國Sigma公司；氯化乙酰膽堿(acetylcholine chloride，ACh)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、氯化鎂(MgCl2)、氯化鈣(CaCl2)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyerhyl) piperazine-1-erhanesulfonic acid,HEPES]、葡萄糖，均購自國藥集團化學試劑有限公司。生理鹽溶液(physiological salt solution,PSS)[5]：NaCl 135 mmol/L、KCl 5 mmol/L、MgCl21 mmol/L、CaCl22 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L，pH=7.40。

1.1.3 儀 器 HV-4離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)、BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)、HW-1000超級恒溫水浴儀,均由成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)；電子分析天平，由沈陽龍騰電子有限公司生產(chǎn)。

1.2 方 法

1.2.1 受試藥物的配制 精密稱取五味子醇甲43.3 mg、五味子醇乙41.6 mg、五味子甲素41.7 mg、五味子乙素40.0 mg、五味子丙素38.4 mg和五味子酯甲53.7 mg，分別加入DMSO配制成1 mol/L的受試藥物母液,使用時用DMSO依次稀釋為10-1，10-2，10-3和10-4mol/L的待測藥物溶液。

1.2.2 大鼠離體氣管環(huán)的預備 大鼠用質(zhì)量分數(shù)25%烏拉坦(4 mL/kg)麻醉后，頸部腹面正中切開皮膚，從甲狀軟骨下部至氣管下部分叉處剪取全部氣管，放入4 ℃的營養(yǎng)液中，去除氣管周圍的脂肪及結(jié)締組織，將氣管剪成長3～5 mm的氣管環(huán)，隨后將氣管環(huán)下端固定，上端連接到張力傳感器上，并置于預先注入10 mL 37 ℃生理鹽溶液的浴槽內(nèi)，持續(xù)通入95% O2和5% CO2混合氣體[6]。大鼠氣管環(huán)的張力信號由BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)記錄。調(diào)節(jié)氣管環(huán)靜息張力至1.0 g，每隔15 min更換新鮮生理鹽溶液1次，穩(wěn)定60 min后開始后續(xù)試驗。

1.2.3 五味子木脂素對氣管環(huán)靜息張力的影響 為了探究五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素和五味子酯甲6種五味子木脂素單體對靜息狀態(tài)下的大鼠氣管環(huán)張力是否有影響，將氣管環(huán)標本分為6組，每組6個重復。待氣管環(huán)張力穩(wěn)定后，每組先后向浴槽中加入10-4～1 mol/L的供試單體溶液，每個濃度加10 μL，因浴槽中預先充入了10 mL生理鹽溶液，因此各單體溶液終濃度為10-7～10-3mol/L，加藥時間間隔以每次加藥后氣管環(huán)張力趨于穩(wěn)定后再加下一個濃度；對照組(CK)加入10 μL體積分數(shù)1‰的DMSO。記錄離體氣管環(huán)張力變化并按下式計算抑制率。

抑制率=(給藥后張力-靜息張力)/靜息張力×100%。

1.2.4 五味子木脂素對ACh預收縮氣管環(huán)張力的影響 向浴槽中加入終濃度為10-6mol/L的ACh誘導氣管平滑肌收縮，待氣管環(huán)收縮幅度趨于平穩(wěn)時，各試驗組向預先充入10 mL生理鹽溶液的浴槽中加入10-4～1 mol/L的五味子木脂素單體10 μL，則其終濃度為10-7～10-3mol/L，每組6個氣管環(huán)；對照組(CK)加入10 μL體積分數(shù)1‰的DMSO。加藥時間間隔以每次加藥后氣管環(huán)張力趨于穩(wěn)定后開始加下一個濃度，記錄每一次氣管環(huán)張力值，按下式計算抑制率[7]。

抑制率=(ACh誘發(fā)氣管環(huán)最大收縮張力-加入待測藥物后的氣管環(huán)張力)/(ACh誘發(fā)氣管環(huán)最大收縮張力-靜息狀態(tài)下氣管環(huán)張力)×100%。

1.2.5 普萘洛爾和維拉帕米對五味子醇甲舒張氣管作用的影響 普萘洛爾和維拉帕米分別為β-腎上腺素受體阻斷劑及L型Ca2+通道阻滯劑。本試驗選取活性較好的氣管環(huán)，用10-5mol/L普萘洛爾、10-5mol/L維拉帕米和體積分數(shù)1‰的DMSO(對照組，CK)分別孵育15 min，然后采用10-6mol/L的ACh預收縮，待氣管環(huán)張力穩(wěn)定后，向浴槽內(nèi)依次加入濃度為10-5，2×10-5，4×10-5，6×10-5，8×10-5，10-4，2×10-4，4×10-4，6×10-4，8×10-4和10-3mol/L的五味子醇甲，加藥間隔方法同1.2.3節(jié)，每組6個氣管環(huán)。觀察氣管環(huán)張力變化情況并計算抑制率(計算方法同1.2.4節(jié))，繪制記錄五味子醇甲對大鼠氣管環(huán)舒張作用的量效曲線[8]。

1.3 統(tǒng)計學處理

每項試驗各組處理后氣管環(huán)張力變化結(jié)果(抑制率)均以“平均值±標準差”表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用SPSS 22.0軟件進行學生t檢驗分析，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種五味子木脂素單體對離體大鼠氣管環(huán)張力的抑制率

6種五味子木脂素對離體大鼠氣管環(huán)張力的抑制率如表1所示。

表1 6種五味子木脂素對離體大鼠氣管環(huán)張力的抑制率Table 1 Inhibition rate of 6 lignans from Schisandra chinensis on tension of isolated rat tracheal rings %

由表1可知，與DMSO對照組比較，10-7～10-3mol/L的6種五味子木脂素單體對離體大鼠氣管環(huán)靜息張力均無顯著影響(P>0.05)，提示五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素和五味子酯甲對離體大鼠氣管環(huán)均無顯著的直接作用。

2.2 6種五味子木脂素對ACh誘導的離體大鼠氣管環(huán)收縮的抑制率

由表2可知，與DMSO對照組相比，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素均呈劑量依賴性地抑制ACh誘導的離體大鼠氣管環(huán)的收縮，最大抑制率分別為(92.12±3.28)%(P<0.001)，(78.23±10.20)%(P<0.001)，(62.95±12.93)%(P<0.001)和(46.58±4.92)%(P<0.001)，可見五味子醇甲的抑制作用最強；而五味子丙素和五味子酯甲對ACh 誘導的離體大鼠氣管環(huán)的收縮功能無顯著影響(P>0.05)。

表2 6種五味子木脂素對ACh誘導的離體大鼠氣管環(huán)收縮的抑制率

2.3 普萘洛爾和維拉帕米在五味子醇甲舒張離體大鼠氣管環(huán)中的作用

圖1-A顯示，與DMSO對照組比較，10-5mol/L的β-腎上腺素受體阻斷劑普萘洛爾孵育氣管環(huán)15 min，對不同濃度五味子醇甲舒張氣管環(huán)作用無明顯影響(P>0.05)；而由圖1-B可知，采用10-5mol/L的L型Ca2+通道阻滯劑維拉帕米孵育氣管環(huán)15 min，與DMSO對照組比較，不同濃度五味子醇甲松弛氣管平滑肌的作用均明顯減弱，最大抑制率降低了(26.24±8.42)%(P<0.001)。結(jié)果提示，五味子醇甲舒張氣管的作用可能與阻斷L型Ca2+通道、阻止細胞外Ca2+內(nèi)流有關，而與β-腎上腺素受體效應無關。

與DMSO組比較， **、***分別表示在P<0.01和P<0.001水平有統(tǒng)計學差異Compared with DMSO group,** and *** indicate difference at P<0.01 and P<0.001,respectively.圖1 普萘洛爾(A)和維拉帕米(B)在五味子醇甲舒張離體大鼠氣管環(huán)中的作用Fig.1 Effects of propranolol (A) and verapamil (B) on relaxation of isolated rat tracheal ring induced by schisandrol A

3 討 論

作為我國的傳統(tǒng)中藥，五味子是止咳平喘的核心藥物之一，也是最常用的抗哮喘中藥之一[9]，然而五味子及其有效成分對氣管平滑肌的功能是否有影響尚不明確。本試驗采用大鼠離體氣管環(huán)進行試驗，可以排除神經(jīng)體液因素對氣管平滑肌的影響，能直接觀察到藥物對氣管平滑肌的作用[10]。將6種五味子木脂素單體成分按濃度累加方式刺激離體大鼠氣管環(huán)，結(jié)果顯示靜息狀態(tài)下的支氣管平滑肌張力沒有明顯變化，提示五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素及五味子酯甲對大鼠離體氣管平滑肌張力無直接影響。

一般狀況下，氣管平滑肌上分布的膽堿能神經(jīng)所釋放的乙酰膽堿可使平滑肌處于靜息狀態(tài)，保持輕微的靜息張力。當細胞外的生物信號與細胞膜表面偶聯(lián)的特異性受體相結(jié)合時，啟動特定的信號轉(zhuǎn)導通路完成信息傳遞，引起平滑肌的收縮或舒張[11]。氣管平滑肌上分布的受體主要為β-腎上腺素能受體、M膽堿能受體和組胺受體。β2腎上腺素受體興奮會引起支氣管平滑肌舒張，M膽堿受體和組胺受體興奮會使支氣管平滑肌收縮[8,12]。為了觀察藥物能否舒張氣管平滑肌，本試驗采用M膽堿受體激動藥ACh預收縮離體大鼠氣管環(huán)，當其張力平穩(wěn)后，以濃度累加方式分別加入6種五味子木脂素單體成分，結(jié)果顯示五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素可劑量依賴性地抑制ACh 誘導的氣管環(huán)收縮，即具有舒張氣管平滑肌的作用，其中五味子醇甲的作用最強，而五味子酯甲和五味子丙素對ACh誘導的氣管環(huán)收縮沒有明顯影響。

氣管平滑肌有多種調(diào)節(jié)機制，主要包括免疫調(diào)節(jié)機制及Ca2+通道和鉀通道調(diào)節(jié)機制3個方面[13-14]。有研究表明，與正常氣道平滑肌細胞相比，哮喘氣道平滑肌細胞內(nèi)Ca2+濃度增加[15-17]，這說明氣道平滑肌細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化是哮喘發(fā)作的重要因素之一。氣道平滑肌的收縮受多種信號通路的調(diào)節(jié)，包括細胞內(nèi)Ca2+釋放、細胞外Ca2+內(nèi)流、Ca2+致敏、Na+/Ca2+交換和BK通道[18-19]。其中，決定因素之一是細胞外Ca2+內(nèi)流，其受電壓依賴性L型Ca2+通道、非選擇性陽離子通道和Na+/Ca2+交換的調(diào)節(jié)[20-22]。ACh能夠激動氣道平滑肌上的M膽堿受體，開啟受體依賴型鈣通道(RDC)和受體操縱型鈣通道(ROC)，使Ca2+內(nèi)流；還可通過細胞膜上磷酸肌醇水解，產(chǎn)生肌醇三磷酸(IP3)和二酯基甘油(DAG)，進而使細胞內(nèi)肌漿網(wǎng)膜上的鈣通道開放，Ca2+釋放，細胞內(nèi)Ca2+增多，從而引發(fā)氣道平滑肌收縮[23-24]。本研究結(jié)果顯示，有4種五味子木脂素單體成分可抑制ACh誘導的氣道平滑肌收縮，其中五味子醇甲作用最強，為了進一步探討五味子醇甲舒張氣道平滑肌的機制，本研究采用了L型Ca2+通道阻斷劑維拉帕米預孵育氣管環(huán)，發(fā)現(xiàn)維拉帕米減弱了五味子醇甲對氣管環(huán)的舒張作用，由此推測五味子醇甲的作用可能與其可抑制L型Ca2+通道從而影響細胞內(nèi)Ca2+濃度有關。同時，為了探究五味子醇甲舒張氣道平滑肌作用與β受體的關系，本研究還采用β-腎上腺素阻斷劑普萘洛爾作為工具藥觀察其影響[25]，結(jié)果顯示離體大鼠氣管環(huán)無論在有或無普萘洛爾孵育的情況下，五味子醇甲對 ACh 預收縮氣管環(huán)張力的影響無顯著差異，說明其對氣道平滑肌的舒張作用與β-腎上腺素受體無關。

五味子木脂素是否是五味子治療肺系疾病的物質(zhì)基礎，還需在后續(xù)的研究中建立哮喘動物模型以進一步驗證。

4 結(jié) 論

五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素具有舒張大鼠氣道平滑肌的作用，且均呈現(xiàn)出劑量依賴性，其中五味子醇甲的舒張作用與阻斷L型Ca2+通道有關，而與β-腎上腺素受體無關。