雞WDR5基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及對PGCs形成相關(guān)基因表達(dá)的影響

張 晨，左其生，鄒藝琛，趙娟娟，張亞妮，李碧春

(揚(yáng)州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

組蛋白甲基化作為重要的表觀遺傳修飾，在不改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)的條件下參與許多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖等[1-3]。Xu等[4]發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3K4me2能促進(jìn)自我更新基因的表達(dá),以維持滋養(yǎng)層干細(xì)胞生長；Lee等[5]發(fā)現(xiàn)，H3K4me3能夠促進(jìn)肌肉和脂肪細(xì)胞的形成； H3K4me3還能通過在心臟特異基因啟動子區(qū)的富集促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[6]。目前，對H3K4甲基化在細(xì)胞分化中的作用研究較多，但對胚胎干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過程中組蛋白甲基化的作用機(jī)制研究尚不多見，尤其是在鳥類研究上。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，H3K4me2能促進(jìn)雞原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells，PGCs)的形成，色氨酸天冬氨酸重復(fù)域5(WD repeat domain 5，WDR5)可改變H3K4me2水平，但是關(guān)于WDR5在PGCs形成中的具體調(diào)控作用還不清楚。

WDR5是組蛋白甲基化修飾酶的關(guān)鍵蛋白之一，參與組蛋白二甲基化和三甲基化的修飾過程[7]，進(jìn)而參與多種生物學(xué)過程[8-11]。 研究表明，小鼠過表達(dá)WDR5后，可激活Wnt信號通路，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化[12]；WDR5還能維持胚胎干細(xì)胞的自我更新和重編程[8,13]。在生殖干細(xì)胞調(diào)控方面，干擾WDR5可控制爪蟾H3K4me3的水平，引起其發(fā)育缺陷[7]；在突變線蟲中，WDR5可引起H3K4me2/3水平降低，最終影響生殖干細(xì)胞的正常發(fā)育[14]。目前對WDR5的研究主要集中在哺乳動物上，盡管已有不少WDR5在生殖干細(xì)胞方面的研究報道，但其對雞PGCs形成的調(diào)控機(jī)理尚不清楚。為此，本研究對WDR5進(jìn)行生物信息學(xué)解析，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-WDR5-GST，并檢測其對PGCs形成相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期為后續(xù)探究WDR5在雞PGCs形成中的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

新鮮如皋黃雞受精蛋，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所試驗禽場提供。PGCs和pcDNA3.1(+)載體，由揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室保存。高糖DMEM、丙酮酸鈉、胎牛血清、胰酶、雞血清，購自Gibco公司(美國)；L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、非必需氨基酸、人干細(xì)胞因子(hSCF)，購自Sigma(美國)；青、鏈霉素和牛血清白蛋白，購自(北京)索萊寶科技有限公司；小鼠白血病抑制因子(mLIF)，購自Millipore(德國)；FuGENE?HD，購自Promega公司(美國)；TRNzol Universal 總 RNA 提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；BCA試劑盒、放射免疫沉淀分析(Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA)裂解液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司(上海)。GST抗體，購自Abcam公司(美國)；山羊抗兔IgG抗體，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 WDR5氨基酸序列分析 利用NCBI在線網(wǎng)站獲得WDR5(NM_001006198.1)的核酸序列，將其導(dǎo)入ProtParam在線分析網(wǎng)站進(jìn)行氨基酸序列分析，同時利用NCBI保守結(jié)構(gòu)域分析在線網(wǎng)站對WDR5的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

1.2.2 WDR5蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 利用Uniport網(wǎng)站、TMHMM Server v. 2.0在線網(wǎng)站和SignalP在線網(wǎng)站，分別對WDR5的親、疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽表達(dá)進(jìn)行分析。

1.2.3 WDR5蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)和互作蛋白預(yù)測 用SWISS-MODEL對WDR5的氨基酸序列進(jìn)行同源建模，對獲得結(jié)果的可用性、序列一致性、蛋白保守性進(jìn)行分析。利用String在線網(wǎng)站對WDR5的互作蛋白進(jìn)行預(yù)測，分析保守的互作蛋白。

1.2.4 重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-WDR5-GST的構(gòu)建 利用NCBI網(wǎng)站獲得WDR5的CDS區(qū)序列，在其起始密碼子和終止密碼子的前面分別添加kozak結(jié)構(gòu)(GCCACC)和GST蛋白的編碼序列，5′端和3′端分別添加KpnⅠ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)，合成該序列后，利用KpnⅠ和EcoR Ⅰ雙酶切3 h，回收產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物與經(jīng)同樣雙酶切的載體pcDNA 3.1(+)連接，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-WDR5-GST。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐抗性的平板過夜培養(yǎng)，次日挑菌，搖菌后提取重組真核表達(dá)載體進(jìn)行KpnⅠ/EcoR Ⅰ雙酶切鑒定。鑒定成功后，將待測菌液送往南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5 WDR5重組蛋白在PGCs中的表達(dá) (1)mRNA水平的檢測。將pcDNA3.1-WDR5-GST重組真核表達(dá)質(zhì)粒(g)和Fugene轉(zhuǎn)染試劑(L)按1∶3的體系轉(zhuǎn)染PGCs細(xì)胞，同時設(shè)置空白組(未處理組)和對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體組)。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。用Trizol裂解液進(jìn)行裂解，提取RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。利用Primer 5.0軟件，針對WDR5基因CDS區(qū)設(shè)計引物，交由南京擎科生物科技有限公司合成。引物信息見表1。以β-actin為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒檢測WDR5基因mRNA的表達(dá)，試驗重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法分析相對表達(dá)量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time fluorescent quantitative PCR primer sequences

(2)蛋白水平的檢測。采用Western blot法檢測WDR5重組蛋白的表達(dá)情況。收集轉(zhuǎn)染后的PGCs細(xì)胞，用RIPA裂解液進(jìn)行蛋白裂解，冰上孵育40 min后，4 ℃、12 000g離心15 min，收集上清液。用BCA試劑盒測定上清液蛋白濃度后,取20 μg蛋白樣品，將其用RIPA裂解液稀釋至20 μL,加入4 μL 6×SDS-PAGE蛋白緩沖液后，100 ℃變性30 min。將各組蛋白用12%的SDS-PAGE進(jìn)行分離，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。室溫下用體積分?jǐn)?shù)1%的牛血清白蛋白封閉液孵育2 h，4 ℃下將膜和特定一抗(GST抗體)孵育過夜，TBST清洗3次后，加入相應(yīng)二抗(羊抗免IgG)孵育2 h，TBST洗滌3次，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影。

1.2.6 WDR5蛋白過表達(dá)對PGCs形成相關(guān)基因的影響 以β-actin為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR試劑盒檢測WDR5對PGCs形成相關(guān)基因(DDX4、C-KIT、BLIMP1、LIN28B和PRDM14)表達(dá)的影響。試驗重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法分析相對表達(dá)量。利用Primer 5.0軟件，針對上述各基因CDS區(qū)設(shè)計引物，交由南京擎科生物科技有限公司合成。引物信息見表1。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫并處理數(shù)據(jù)，用單因素方差分析檢驗組間差異，采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 WDR5氨基酸序列分析

分析結(jié)果顯示，WDR5核酸序列可編碼334個氨基酸，分子質(zhì)量為36 565.41 u，理論等電點(diǎn)(PI)為8.54，半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為30.81。WDR5含有1個保守結(jié)構(gòu)域WD40，該結(jié)構(gòu)域含有7個WD40重復(fù)序列。結(jié)果說明,WDR5蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白，保守結(jié)構(gòu)域為WD40。

2.2 WDR5蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

結(jié)果顯示，WDR5親水性高，不屬于膜蛋白；WDR5不含跨膜結(jié)構(gòu)域，無信號肽表達(dá)。結(jié)果表明，WDR5不屬于跨膜蛋白，可能為核表達(dá)蛋白。

2.3 WDR5三級結(jié)構(gòu)和互作蛋白分析

用SWISS-MODEL對雞WDR5進(jìn)行同源建模，結(jié)果匹配到的蛋白質(zhì)描述為WDR5，與雞的WDR5一致度為96.71%，大于30%，說明數(shù)據(jù)可用；全球性模型質(zhì)量估測(Global Model Quality Estimation, GMQE)值為0.93，說明數(shù)據(jù)質(zhì)量較好；匹配度QMEAN4為-0.68，接近0，說明待測蛋白與模板蛋白匹配度高。以上結(jié)果說明，雞WDR5蛋白保守性較高。

利用String在線網(wǎng)站對WDR5的互作蛋白進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明雞上預(yù)測到的與WDR5結(jié)合的蛋白包括DPY30、類ASH2蛋白(ASH2 Like，ASH2L)、RB結(jié)合蛋白5(RB Binding Protein 5，RBBP5)和MLL2等組蛋白甲基化酶compass組分。該結(jié)果進(jìn)一步說明，WDR5的保守性較高，屬于compass組分成員(圖1)。

圖1 雞WDR5互作蛋白分析Fig.1 Interaction protein analysis of chicken WDR5

2.4 重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-WDR5-GST的鑒定

對構(gòu)建的pcDNA3.1-WDR5-GST進(jìn)行KpnⅠ/EcoR Ⅰ 雙酶切，獲得了1 677 bp的目的片段和約5 400 bp的載體片段(圖2)。測序結(jié)果顯示，WDR5已插入pcDNA3.1(+)載體，未發(fā)生移碼和突變現(xiàn)象。KpnⅠ/EcoR Ⅰ 雙酶切和測序結(jié)果說明，重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-WDR5-GST構(gòu)建成功，可用于后續(xù)試驗。

2.5 WDR5重組蛋白在PGCs細(xì)胞中的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果(圖3-A)顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-WDR5-GST載體后，WDR5基因的表達(dá)水平極顯著高于對照組(P<0.01)。Western blot結(jié)果(圖3-B)顯示，重組蛋白分子質(zhì)量約為62 ku(GST標(biāo)簽蛋白約26 ku，WDR5約36 ku)。以上結(jié)果說明，重組真核表達(dá)載體能穩(wěn)定表WDR5重組蛋白。

M.DL10000 DNA Marker；1.Kpn Ⅰ/EcoR Ⅰ雙酶切產(chǎn)物；2.pcDNA3.1-WDR5-GST M.DL10000 DNA Marker;1.Restriction enzyme fragments by Kpn Ⅰ/EcoR Ⅰ;2.pcDNA3.1-WDR5-GST 圖2 重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-WDR5-GST的雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pcDNA3.1-WDR5-GST

A.基因水平檢測；B.蛋白水平檢測。**.表示與對照組差異極顯著(P<0.01)，圖4同A.The detection of gene expression;B.The detection of protein expression.**.This means that the difference between the two groups is very significant (P<0.01),the same for Fig.4

2.6 WDR5過表達(dá)對PGCs形成相關(guān)基因的影響

收集轉(zhuǎn)染后的PGCs細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR檢測，結(jié)果(圖4)顯示，過表達(dá)WDR5后，PGCs標(biāo)記基因DDX4、C-KIT、BLIMP1、LIN28B和PRDM14表達(dá)水平均極顯著升高(P<0.01)，說明WDR5過表達(dá)對PGCs形成相關(guān)基因的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用。

圖4 WDR5過表達(dá)條件下PGCs相關(guān)基因表達(dá)水平的變化Fig.4 Expression of PGCs related genes after overexpression of WDR5

3 討 論

WDR5是組蛋白甲基化復(fù)合物組分之一，具有典型的WD40核心亞基。WD40結(jié)構(gòu)域通常以螺旋形式出現(xiàn)，包含7個區(qū)域。特異性的WD40螺旋結(jié)構(gòu)有助于蛋白之間的結(jié)合[7,15]。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，雞WDR5蛋白具有典型的WD40結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有7個WD40重復(fù)序列，說明在雞上WDR5具有物種保守性?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，WD40結(jié)構(gòu)域參與了多種生物學(xué)過程，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞骨架組裝、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、染色質(zhì)動力學(xué)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[16-20]。含有WD40亞基的WDR5可作為組蛋白甲基化酶復(fù)合體成分，基于前期研究得出的H3K4me2參與雞PGCs形成[21]的結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)，WDR5基因過表達(dá)會提高PGCs相關(guān)基因的表達(dá)水平。有研究表明，在雞上降低DDX4會減少PGCs的數(shù)量[22]；BLIMP1、PRDM14是決定生殖細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵基因[23-24]，C-KIT和LIN28B則是PGCs生長發(fā)育必不可少的基因[25]。Robert等[26]發(fā)現(xiàn)，WDR5在維持秀麗隱桿線蟲生殖細(xì)胞多能性方面有重要作用。據(jù)此推測，WDR5在雞PGCs形成中可能也有重要作用，而其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，WDR5不含跨膜結(jié)構(gòu)域，親水性高，無信號肽表達(dá)，說明其不屬于膜蛋白。研究表明，WDR5是高度保守的核蛋白，參與許多與染色質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)過程[27]，因此推測雞WDR5可能在細(xì)胞核中表達(dá)。三級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，雞WDR5具有高度保守性，匹配一致度為96.71%。有研究表明，WDR5通常與ASH2L、DPY30和RBBP5組成甲基化酶復(fù)合體[28]，可激活甲基轉(zhuǎn)移酶MLL家族活性。且WDR5含有特殊的“Win motif”結(jié)構(gòu)，而該結(jié)構(gòu)是其與MLL家族蛋白結(jié)合所必需的。以上研究說明，WDR5通常以“支架”蛋白的形式在復(fù)合體中發(fā)揮作用[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，雞WDR5的互作蛋白包括人們所熟知的復(fù)合體組分ASH2L、RBBP5和DPY30，復(fù)合體蛋白激活的核心蛋白可能為MLL家族的MLL2蛋白。Dias等[30]發(fā)現(xiàn)，果蠅中WDR5與NSL的2個亞基KANSL1和KANSL2發(fā)生相互作用，這與本研究結(jié)果(KAT8調(diào)控因子NSL復(fù)合物亞基3(KAT8 Regulatory NSL Complex Subunit 3，KANSL3)可能與WDR5結(jié)合)不同，造成這一差異的原因可能是物種不同所致，但這還需進(jìn)一步驗證。

基于WDR5蛋白的互作能力，探究WDR5在原始生殖細(xì)胞形成過程中的作用機(jī)制時，需要可用于Co-IP和CHIP試驗的抗體。然而由于雞種屬的特殊性，目前尚無同時滿足二者要求的商品化抗體。因此，本研究構(gòu)建了重組pcDNA3.1-WDR5-GST真核表達(dá)載體，通過定量和Western blot驗證其活性，以用于后續(xù)Co-IP和CHIP試驗。

4 結(jié) 論

雞WDR5蛋白含有典型的WD40亞基，不含跨膜結(jié)構(gòu)域，也無信號肽表達(dá)，為親水性蛋白，具有高度保守性，互作蛋白包括ASH2L、RBBP5、DPY30和KANSL3。成功構(gòu)建了pcDNA3.1-WDR5-GST重組真核表達(dá)載體，并驗證了其mRNA和蛋白水平的活性；過表達(dá)WDR5可提高PGCs形成相關(guān)基因的表達(dá)水平。