SIRT3 HIF-1α FAP和HGF在不同臨床分期胃癌組織中的表達(dá)及意義*

鄭磊 劉立杰 康麗影 程嚴(yán) 高立明

(1.秦皇島市第一醫(yī)院腫瘤一科，河北 秦皇島 066000;2.天津市武清區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，天津 300000;3.秦皇島市第一醫(yī)院消毒供應(yīng)室，河北 秦皇島 066000)

胃癌是我國發(fā)病率第一的消化道惡性腫瘤，由于該疾病在早期缺乏特異性癥狀，早期診斷困難，多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期，治療效果不佳[1]。因此，尋求特異性生物學(xué)標(biāo)志物對胃癌患者早期診斷與治療意義重大[2]。當(dāng)前，已發(fā)現(xiàn)多種物質(zhì)可作為潛在的胃癌標(biāo)志物，如糖類抗原、癌胚抗原、miRNAs、成纖維生長因子等[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，去乙酰化酶3(SIRT3)和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)參與了腫瘤細(xì)胞能量代謝、血管生成，并與肝細(xì)胞生長因子(HGF)一樣，可影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤等過程[4-6]；成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)是癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(TAFs)的特異性標(biāo)志物，參與了細(xì)胞外基質(zhì)的重塑與血管生成，在腫瘤細(xì)胞的的侵襲轉(zhuǎn)移過程中，也發(fā)揮了重要作用[7]。當(dāng)前，有關(guān)SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF在胃癌中表達(dá)的研究已有報(bào)道，但系統(tǒng)地研究以上指標(biāo)在不同臨床分期胃癌組織中的表達(dá)及其表達(dá)相關(guān)性的報(bào)道較少。為進(jìn)一步了解SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF表達(dá)與胃癌臨床分期的關(guān)系及在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，本研究采用疫組化法檢測其在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)水平，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6月～2018年12月秦皇島市第一醫(yī)院收治的胃癌患者83例，其中男48例，女35例，年齡45～78歲，平均(61.74±10.38)歲；分化程度：高分化腺癌13例，中分化腺癌25例，低分化腺癌28例，未分化17例；胃癌TNM分期：T分期(原發(fā)灶)：T1+T2(無血管受侵+有血管受侵或多發(fā)腫瘤直徑≤5cm)16例，T3+T4(多發(fā)腫瘤直徑>5cm+侵及周圍組織)67例；N(區(qū)淋巴結(jié))分期：N0(無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)28例，N1(區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)55例；M(遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)分期：M0(無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)52例，M1(有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)31例。取患者的原發(fā)腫瘤組織和癌旁正常組織(距離腫瘤組織邊緣>5 cm)制作3 μm切片標(biāo)本。取樣后立即放入液氮保存，福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為胃癌。②患者均為原發(fā)病灶首次手術(shù)切除，術(shù)前未接受放化療。③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他嚴(yán)重腫瘤疾病。本研究患者知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 所有石蠟標(biāo)本4～5 μm連續(xù)切片，依次二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化，枸櫞酸緩沖液(0.01 mol/L)微博抗原熱修復(fù)，羊血清室溫下封閉。加入即用型一抗(鼠抗人HIF-1α單抗、兔抗人SIRT3單抗、HGF兔多克隆抗體、鼠抗人FAP單抗)，4℃低溫過夜，PBS清洗，加入免疫組織化學(xué)試劑1、2溫育0.5 h，清洗后DAB顯色，蘇木精對比染色，中性樹膠封固。由兩位高資歷的病理科?？漆t(yī)生進(jìn)行雙盲式獨(dú)立閱片，每例觀察2張切片，于顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域進(jìn)行觀察。

1.2.2 結(jié)果判定 HIF-1α的染色結(jié)果判定根據(jù)腫瘤細(xì)胞的染色比例進(jìn)行判定，以已知的表達(dá)陽性組織切片為陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照。以(+)～(+++)為陽性，其中，(-)為陰性，細(xì)胞核未染色或染色范圍<1%；(+)為弱陽性，細(xì)胞核染色范圍為1%～10%，存在較弱的胞質(zhì)染色；(++)為中度陽性，細(xì)胞核染色范圍為10%～50%，存在明顯的胞質(zhì)染色；(+++)為強(qiáng)陽性，細(xì)胞核染色范圍>50%，胞質(zhì)染色較強(qiáng)。SIRT3的染色結(jié)果判定根據(jù)腫瘤細(xì)胞棕黃色陽性信號的強(qiáng)弱及染色面積進(jìn)行判定。以(+)～(+++)為陽性，其中(-)為陰性，陽性率≤5%；(+)為弱陽性，陽性率為6%～25%，胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色顆粒；(++)為中度陽性，陽性率為26%～50%，胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒；(+++)為強(qiáng)陽性，陽性率>50%，胞質(zhì)中出現(xiàn)棕褐色顆粒。FAP和HGF的染色結(jié)果判定根據(jù)陽性染色細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行判定[8]。以(+)～(+++)為陽性，陽性染色細(xì)胞百分比計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為：<5%記0分，5%～24%記1分，25%～49%記2分，>50%記3分；染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為：無色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。二者計(jì)分乘積為最終結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF在癌組織和癌旁正常組織中陽性表達(dá)比較 SIRT3在胃癌組織中的陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中(見圖1A)，其陽性表達(dá)率低于在癌旁組織中的陽性表達(dá)率(P<0.05)；HIF-1α和HGF在胃癌組織中的陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核(見圖1B、圖1C)，二者在胃癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織(P<0.05)；FAP在胃癌組織中的表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，陽性表達(dá)率為51.81%(見圖1D)，在癌旁組織中不表達(dá)(P<0.05)。見表1。

圖1 胃癌組織中SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF的陽性表達(dá)(200×)

表1 SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF在癌組織和癌旁正常組織中陽性表達(dá)比較[n×10-2)]

2.2 SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF在不同臨床分期胃癌組織中的表達(dá)比較 SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF在不同臨床分期胃癌組織中的陽性表達(dá)比較[n(×10-2)]

2.3 胃癌組織中SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF表達(dá)之間的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，83例胃癌組織中SIRT3與HIF-1α、FAP、HGF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；HIF-1α與FAP、HGF的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)；FAP與HGF的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.508，P=0.032)，見表3、表4。

表3 SIRT3的表達(dá)與HIF-1α、FAP和HGF表達(dá)的相關(guān)性分析

表4 HIF-1α的表達(dá)與FAP、HGF表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

SIRT3是一種去乙?；?，可參與氧化途徑的激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧穩(wěn)態(tài)，與細(xì)胞死亡和腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，被認(rèn)為是線粒體內(nèi)的抑癌基因[9]；HIF-1α是決定HIF-1活性的氧調(diào)節(jié)亞單位，可參與腫瘤細(xì)胞能量代謝、轉(zhuǎn)移及血管生成等[10]；FAP是腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制物，可抑制機(jī)體的免疫效應(yīng)，參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[11]；HGF是一種血管形成刺激因子，除刺激新生血管形成外，還參與了腫瘤細(xì)胞的分裂、遷移和形態(tài)變化，在多種癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)[12]。本研究結(jié)果顯示，SIRT3在胃癌組織中的陽性表達(dá)主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，其陽性表達(dá)率低于在癌旁組織中的陽性表達(dá)率，與高立明等[13]的研究結(jié)果類似。SIRT3可通過錳超氧化物歧化酶(MnSOD)的歧化反應(yīng)減少細(xì)胞內(nèi)活性氧，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化活性，當(dāng)SIRT3表達(dá)降低時(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧隨之上升，導(dǎo)致脂質(zhì)和蛋白的穩(wěn)定狀態(tài)被打破，加速腫瘤細(xì)胞的遷移與惡性轉(zhuǎn)變[14]。這也是SIRT3在胃癌組織中表達(dá)水平較低的原因。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3的低表達(dá)可介導(dǎo)HIF-1α的穩(wěn)定性[15]。本研究結(jié)果顯示，HIF-1α在胃癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，提示HIF-1α?xí)谖赴┙M織中過度表達(dá)。吳友亮等[16]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α mRNA和蛋白在胃癌組織中的相對表達(dá)量高于癌旁正常組織，且胞核定位陽性率高于胞質(zhì)，認(rèn)為HIF-1α的不同定位與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究中HIF-1α在胃癌組織中的陽性表達(dá)也主要位于細(xì)胞核，可能與HIF-1α胞質(zhì)定位無生物學(xué)作用，HIF-1α只有進(jìn)入胞核內(nèi)才能發(fā)揮調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的作用有關(guān)[17]。

對比胃癌組織與癌旁組織中HGF的陽性表達(dá)率可知，其在胃癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，與谷光福等[18]的研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)HGF在胃癌組織中及癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為79.8%和45.7%，認(rèn)為在腫瘤增殖和侵襲過程中，HGF/肝細(xì)胞生長因子受體(c-Met)通路被激活，促進(jìn)了腫瘤血管生成和化療抵抗，因此HGF低表達(dá)者病情進(jìn)展更慢、總生存期更長。此外，本研究中FAP在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為51.81%，在癌旁組織中不表達(dá)，與湯蘇敏等[19]的研究結(jié)果一致。

進(jìn)一步分析SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF與胃癌臨床分期關(guān)系顯示，四者在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌TNM分期顯著相關(guān)，且腫瘤侵襲周圍組織、存在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者，SIRT3表達(dá)水平越低，HIF-1α、FAP和HGF表達(dá)水平越高，提示四者可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，且SIRT3對胃癌的發(fā)展過程具有一定的抑制作用。分析其原因可能是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中會出現(xiàn)乏氧現(xiàn)象，缺氧條件下HIF-1α可提高參與葡萄糖代謝、血管生成等的重要基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而提高胃癌細(xì)胞的侵襲能力，當(dāng)SIRT3表達(dá)水平下降時(shí)，HIF-1α活性增加，促進(jìn)了腫瘤表型的顯現(xiàn)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3可作用于多種酶參與氧化途徑的激活，低表達(dá)水平的SIRT3會導(dǎo)致錳超氧化物歧化酶(MnSOD)表達(dá)降低，從而增高細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)濃度，而高濃度的ROS會影響基因、脂質(zhì)和蛋白的穩(wěn)定性[21]，可能在一定程度上影響TAFs的表達(dá)，進(jìn)而影響FAP和HGF等細(xì)胞因子的生成。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，83例胃癌組織中SIRT3與HIF-1α、FAP、HGF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，HIF-1α與FAP、HGF的表達(dá)呈正相關(guān)，F(xiàn)AP與HGF的表達(dá)呈正相關(guān)，提示四者在胃癌組織中的表達(dá)均存在相關(guān)性。逯頂松等[22]采用RNA干擾技術(shù)，使SIRT3基因表達(dá)下調(diào)或缺失，觀察其下調(diào)或缺失后對HIF-1α表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，SIRT3-小干擾RNA轉(zhuǎn)染后，SIRT3蛋白表達(dá)明顯下降，HIF-1α表達(dá)明顯升高，HIF-1α的表達(dá)受SIRT3調(diào)控，且二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。由于目前未見HIF-1α、FAP和HGF表達(dá)水平的相關(guān)性研究，有關(guān)三者在胃癌組織中的表達(dá)均存在相關(guān)性這一結(jié)論有待后續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

SIRT3、HIF-1α、FAP和HGF的表達(dá)水平與胃癌的TNM分期存在相關(guān)性，它們可能共同參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，SIRT3的表達(dá)可能起到負(fù)向調(diào)控HIF-1α、FAP和HGF的作用。