SOX21在胃癌中的表達(dá)和甲基化狀態(tài)及對(duì)體外胃癌細(xì)胞的作用*

李麗萍 賈筠 蔡永昌 賴慶君 彭堯

(1.東莞市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科四區(qū)，廣東 東莞 523059; 2.東莞市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東 東莞 523059;3.東莞市人民醫(yī)院胃腸外科，廣東 東莞 523059;4. 廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510095)

胃癌(gastric cancer，GC)是世界上第四大最常見(jiàn)的癌癥，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。2018年，胃癌的發(fā)病率在全球排名第六，新增病例為1,033,701例(占所有癌癥類型的新增病例的5.7%)[1]。癌癥作為一種復(fù)雜的多因素疾病，是遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)途徑之間相互作用的結(jié)果。表觀遺傳學(xué)研究表明，DNA甲基化通過(guò)干擾DNA和染色質(zhì)分子結(jié)構(gòu)在促進(jìn)胚胎發(fā)育、衰老和許多類型的癌癥中必不可少[2]。促癌基因啟動(dòng)子低甲基化和抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化是腫瘤的一個(gè)重要的特征。因此，基因的異常甲基化可以作為不同癌癥類型的標(biāo)志，并可用于癌癥的診斷和分類[3]。性別決定區(qū)Y-BOX 21(sex-determining region Y- box 21，SOX21)是SOX家族蛋白質(zhì)B2組的成員之一，位于13q32.1染色質(zhì)上，具有高遷移率基團(tuán)DNA結(jié)合域，在胚胎發(fā)育、神經(jīng)和牙齒形成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。最近的研究表明，在大腸癌組織中，SOX21基因啟動(dòng)子甲基化率明顯高于癌旁組織，SOX21基因啟動(dòng)子甲基化可作為大腸癌患者糞便和血漿中一種潛在的非侵入性診斷標(biāo)志物[5]。目前，關(guān)于SOX21基因在胃癌中的甲基化狀態(tài)及對(duì)胃癌細(xì)胞的作用尚不明確。Wnt信號(hào)通路影響細(xì)胞生長(zhǎng)、胚胎發(fā)育、腫瘤細(xì)胞分裂、增殖、腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后[6]。Zhou W等[7]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和血管生成。本研究探討SOX21在胃癌組織中的表達(dá)及甲基化水平，進(jìn)一步分析SOX21是否通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮作用，以期為明確胃癌的發(fā)病機(jī)制、開(kāi)發(fā)新的胃癌診斷靶點(diǎn)及治療策略提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年4月～2017年5月于東莞市人民醫(yī)院行胃癌根治術(shù)患者的癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織各44例。其中男23例，女21例，年齡34～71歲，平均(53.181±10.775)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)影像學(xué)及組織學(xué)檢查診斷為原發(fā)性胃癌。②患者術(shù)前未進(jìn)行放、化療及生物治療。③患者無(wú)其他腫瘤或重大疾病。④組織標(biāo)本經(jīng)我院病理科鑒定，確認(rèn)為癌組織及癌旁組織。

1.2 主要材料 胃癌細(xì)胞株AGS和人胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；SOX21過(guò)表達(dá)慢病毒液(簡(jiǎn)稱SOX21)及其陰性對(duì)照慢病毒液(簡(jiǎn)稱NC)購(gòu)自武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司；DNA提取試劑盒和DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；SOX21抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；β-catenin、c-myc、cyclinD1、MMP7和GAPDH抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染 AGS和GES-1細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，0.25%胰酶液消化細(xì)胞，收集細(xì)胞。MSP檢測(cè)AGS和GES-1細(xì)胞中SOX21啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)SOX21的表達(dá)。此外，將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的AGS細(xì)胞接種于6孔板中(4×105個(gè)/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、NC組和SOX21組。棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，添加含有6μg/mL polybrene的2mL新鮮培養(yǎng)基，NC組和SOX21組分別加入NC和SOX21慢病毒液各70MOI，空白對(duì)照組加入等量PBS，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)檢測(cè)組織和細(xì)胞SOX21啟動(dòng)子甲基化狀態(tài) 收集AGS和GES-1細(xì)胞，GC組織及其癌旁組織，按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞和組織的總DNA并測(cè)定DNA濃度及純度。取1000ng DNA樣品，參照DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及DNA純化。根據(jù)SOX21基因序列信息，利用 Methyl Primer Express v1.0 軟件設(shè)計(jì)SOX21基因的甲基化引物和去甲基化引物。甲基化上游引物：5′- ATGGAATTCTCTTCTTGGCT CCGGGCAGGGTG-3′，甲基化下游引物；5′-ATGA AGCTTCTGAGCCGGTGCAGAGGGCG-3′；去甲基化上游引物：5′-ATGGAATTCGTTTAGGCGAGTG GAGAGTCCG-3′，去甲基化下游引物：5′-ATGCTCG AGAATCTTTAGGACAAAACTGAGC-3′。 擴(kuò)增條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)SOX21 mRNA表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞和組織總RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)SOX21 mRNA表達(dá)。反應(yīng)條件：95℃、30s；95℃、5s，60℃、34s，40個(gè)循環(huán)。SOX21以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算其mRNA表達(dá)。SOX21上游引物：5′- GCACAACTCGGAGATCAGCA-3′， SOX21下游引物：5′-CCGGGAAGGCGAACTTGTC-3′； GAPDH上游引物：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′， GAPDH下游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

1.3.4 免疫組化檢測(cè)組織中SOX21表達(dá) GC組織及其癌旁組織用4%多聚甲醛固定72h，梯度酒精脫水，二甲苯透明。石蠟包埋、切片。常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2避光孵育15min，PBS清洗后，5%BSA避光孵育1h，SOX21抗體(1∶200)4℃孵育過(guò)夜。二抗(1∶400)避光孵育1h。DAB顯色液顯色，蘇木素染液染色5min。自來(lái)水沖洗，1%鹽酸酒精溶液分化10s。0.2%氨水做返藍(lán)處理8s。切片經(jīng)自來(lái)水沖洗后，進(jìn)行脫水、透明處理，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察分析。通過(guò)染色強(qiáng)度和面積分?jǐn)?shù)的總和評(píng)估IHC分?jǐn)?shù)。 染色強(qiáng)度：0表示無(wú)染色，1表示弱染色，2表示中度染色，3表示強(qiáng)染色。 染色面積：0表示0%～5%，1表示6%～25%，2表示26%～50%，3表示> 50%。

1.3.5 Western blot檢測(cè)SOX21和Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá) RIPA裂解液裂解細(xì)胞或組織，收集上清，BCA法測(cè)定其蛋白濃度。取各樣品30μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)法將膠塊中的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉，SOX21抗體(1∶1000)、β-catenin抗體(2∶1000)、c-myc抗體(2∶1000)、cyclinD1抗體(2∶1000)、MMP7抗體(1∶1000)和GAPDH抗體(1∶5000)4℃孵育過(guò)夜， 二抗(1∶5000)室溫孵育1h。 ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光。

1.3.6 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力 將慢病毒感染后的AGS細(xì)胞接種于96孔板(5×103個(gè)細(xì)胞/孔)，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72h后，向每孔細(xì)胞中加入10μL CCK-8，37℃條件下孵育3h。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm處的光密度(OD)值。

1.3.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 0.25%胰酶消化慢病毒感染后的AGS細(xì)胞，新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。取200個(gè)AGS細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)2周。PBS清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染液染色1h，流水緩慢洗去染液，空氣干燥，觀察細(xì)胞克隆形成數(shù)量。

1.3.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將AGS細(xì)胞接種于6孔板(5×106個(gè)細(xì)胞/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24h 。收集AGS細(xì)胞，加入300μL 的1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞。加入5μL的Annexin V-FITC，室溫避光孵育15min。隨后再加入5μL的PI染色，補(bǔ)加200μL的1×Binding Buffer，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.9 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 遷移實(shí)驗(yàn)：上腔室加入100μL 含5×104個(gè)AGS細(xì)胞的細(xì)胞懸液，下腔室加入500μL含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、 5%CO2條件下培養(yǎng)24h。5%戊二醛4℃條件下固定，0.1%結(jié)晶紫室溫染色30min，顯微鏡下觀察。侵襲實(shí)驗(yàn)：無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel。取100μL稀釋液加入上腔室中，37℃孵育至凝固。隨后按照遷移實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SOX21在胃癌組織中的甲基化率及表達(dá)水平 與癌旁組織相比，GC組織中SOX21甲基化率明顯升高(P<0.001)，SOX21 IHC評(píng)分、mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

圖1 SOX21在胃癌組織中的甲基化及表達(dá)水平

表1 GC組織和癌旁組織中SOX21甲基化狀態(tài)

2.2 SOX21在胃癌細(xì)胞中的甲基化及表達(dá)水平 SOX21在GES-1細(xì)胞中呈去甲基化狀態(tài)，而在AGS中呈完全甲基化狀態(tài)。與GES-1細(xì)胞相比，AGS細(xì)胞中SOX21 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 SOX21在胃癌細(xì)胞中的甲基化及表達(dá)水平

2.3 過(guò)表達(dá)SOX21對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響 與NC組相比，SOX21組中SOX21 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，24、48、72h細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)，克隆形成數(shù)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 過(guò)表達(dá)SOX21對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

2.4 過(guò)表達(dá)SOX21對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響 與NC組相比，SOX21組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 過(guò)表達(dá)SOX21對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

2.5 過(guò)表達(dá)SOX21對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與NC組相比，SOX21組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 過(guò)表達(dá)SOX21對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響(200×)

2.6 過(guò)表達(dá)SOX21對(duì)Wnt/β-catenin通路的影響 與NC組相比，SOX21組細(xì)胞中β-catenin、c-myc、cyclinD1和MMP7蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05),見(jiàn)圖6。

圖6 過(guò)表達(dá)SOX21對(duì)Wnt/β-catenin通路的影響

3 討論

GC是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。80%的GC患者早期無(wú)明顯癥狀，確診時(shí)已進(jìn)入晚期，盡管進(jìn)行了胃切除術(shù)和化療治療，患者的5年生存率仍然不到20%[8]。因此，GC的早期診斷和治療尤為重要。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一種表現(xiàn)形式，是基因表達(dá)調(diào)控的重要機(jī)制。啟動(dòng)子的異常甲基化在腫瘤早期診斷、療效預(yù)測(cè)、預(yù)后評(píng)估和指導(dǎo)個(gè)體化治療等方面具有重要作用[9]。SOX21在膠質(zhì)瘤形成過(guò)程中可能通過(guò)改變SOX 2和SOX 21之間的平衡而發(fā)揮腫瘤抑制作用，SOX2/ SOX21軸可能成為膠質(zhì)瘤新的治療靶點(diǎn)[10]。

SOX13是BOX家族D組成員之一，是胚胎發(fā)育和軟骨形成的重要調(diào)節(jié)因子。SOX13在腫瘤組織中的表達(dá)高于在配對(duì)的非腫瘤組織中的表達(dá)。SOX13表達(dá)上調(diào)與肝癌患者分化差、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、總體及無(wú)瘤生存率差有關(guān)[11]。SOX6和SOX21可能是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一個(gè)預(yù)后標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)[2]。對(duì)結(jié)直腸癌組織和糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SOX21基因啟動(dòng)子發(fā)生異常高甲基化[13]。此外，已有研究表明，從正常胃黏膜組織經(jīng)由萎縮性胃炎最后發(fā)展到胃癌過(guò)程中，SOX21蛋白表達(dá)量逐漸下調(diào)，提示SOX21在胃癌中可能發(fā)揮著抗腫瘤作用[14]。本研究結(jié)果顯示，SOX21基因啟動(dòng)子在GC組織中呈異常甲基化狀態(tài)，SOX21表達(dá)下調(diào)。同樣的，在GC細(xì)胞株中SOX21基因啟動(dòng)子也發(fā)生異常甲基化，SOX21表達(dá)下調(diào)。過(guò)表達(dá)SOX21后，GC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力明顯下調(diào)，細(xì)胞凋亡率明顯上調(diào)。該結(jié)果表明，SOX21在胃癌中發(fā)揮著抗腫瘤作用。

有證據(jù)表明，Wnt/β-catenin信號(hào)過(guò)度激活廣泛存在于不同惡性腫瘤中，尤其是消化系統(tǒng)腫瘤，因此靶向抑制Wnt/β-catenin通路在抑制腫瘤進(jìn)展方面具有巨大應(yīng)用潛力[15]。研究表明，促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的主要級(jí)聯(lián)基因，包括WNT11、FZD家族和DVL2，在高危侵襲性胃腸道間質(zhì)瘤中上調(diào)[16]，該結(jié)果表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活對(duì)侵襲性胃腸道間質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。腫瘤壞死因子受體超家族成員11B促進(jìn)了GC細(xì)胞的侵襲，并激活了Wnt/β-catenin信號(hào)通路[17]。維甲酸相關(guān)孤兒受體可通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制胃癌細(xì)胞增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲[18]。同樣的，沉默T-box3可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路中Wnt3α、β-catenin和c-myc的表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin通路激活，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[19]。李萍等的研究結(jié)果也表明，上調(diào)Wnt/β-catenin通路中Wnt、β-catenin、cyclinD1和c-myc的表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖并抑制凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SOX21后，可下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中β-catenin、c-myc、cyclinD1和MMP7蛋白表達(dá)。

4 結(jié)論

SOX21基因啟動(dòng)子在GC組織和細(xì)胞中異常甲基化，過(guò)表達(dá)SOX21可能通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制GC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果為明確胃癌的發(fā)病機(jī)制、開(kāi)發(fā)新的胃癌診斷靶點(diǎn)及治療策略提供了新的科學(xué)依據(jù)。