種植密度和施氮量互作對鹽堿地紫花苜蓿生長性能和生理特性的影響

盧發(fā)光，顧立峰，劉昱茜，任 楨，施 雨，徐振然，周桂生，盧海潼，王小山，張網(wǎng)定，任志強(qiáng)，朱廣龍

（1.揚(yáng)州大學(xué)教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；4.揚(yáng)州市氣象局，江蘇揚(yáng)州 225009；5.山西省呂梁市臨縣畜牧技術(shù)推廣站，山西呂梁 033200）

土地鹽堿化嚴(yán)重威脅作物正常生長，限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)共同面臨的困難[1-2]。中國是鹽堿地大國，鹽堿荒地和影響耕種的鹽堿地總面積超過3.33×107hm2，其中具有農(nóng)業(yè)發(fā)展?jié)摿Φ恼贾袊乜偯娣e的10%以上[3]。鹽土種植業(yè)是農(nóng)業(yè)綜合生態(tài)開發(fā)的主要部分，具有不可替代性[4-5]。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是當(dāng)今世界栽培最廣泛的牧草之一，因具有干草產(chǎn)量高、草地持久性強(qiáng)、耐旱、耐寒性強(qiáng)、易成活等特點(diǎn)，適合在鹽堿地種植，在修復(fù)土壤環(huán)境中也有重要潛力，并且多年種植對鹽堿地改良具有明顯效果[6-7]。施肥是提高紫花苜?？剐?、確保其資源可持續(xù)利用的有效方法，但過量施用則會影響其對其他營養(yǎng)的吸收，并且造成肥料浪費(fèi)和環(huán)境污染[8]。因此，合理施肥是調(diào)節(jié)生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分平衡、維持和提高土壤肥力的重要措施之一。本研究以紫花苜蓿WL919為材料，在江蘇沿海灘涂鹽堿地設(shè)置密度和施氮量兩個(gè)試驗(yàn)因子，研究不同種植密度以及施氮量對鹽堿地紫花苜蓿產(chǎn)量、生理特性等的影響，以期為沿海鹽堿地苜蓿高產(chǎn)栽培提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2019?2020年在江蘇省鹽城市大豐區(qū)大豐沿海林場(33°20′N，120°47′E)鹽堿地進(jìn)行。該地區(qū)屬亞熱帶與暖濕帶的過渡地帶，四季分明，氣溫適中，常年平均氣溫14.1℃，雨量充沛，常年降水總量1042.2 mm，適宜喜濕作物的生長，無霜期213 d，年日照2 238.9 h。試驗(yàn)地土壤pH 8.4，有機(jī)質(zhì)含量19.75 g·kg?1，全氮含量0.72 g·kg?1，速效磷含量1.45 mg·g?1，速效鉀含量279 mg·g?1，鹽分(主要包括氯化鹽、碳酸鹽)平均含量為1.68 g·kg?1。

1.2 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料為紫花苜蓿WL919，設(shè)置3個(gè)播種量15.0(D1)、30.0(D2)和45.0 kg·hm?2(D3)，3個(gè)施氮量150.0(N1)、225.0(N2)和300.0 kg·hm?2(N3)，播種方式為撒播，覆土深2～4 cm。采用種植密度和施氮量2個(gè)因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，小區(qū)面積為30 m2。氮肥按5?5分別作基肥和返青肥施入。此外，每個(gè)處理施磷肥225 kg·hm–2，在播種前作基肥施入，2019年11月5日播種。

1.3 取樣與測定

在紫花苜蓿全年生育期共取樣4次，分別于播種后60 d(苗期)、90 d(分枝期)、120 d(現(xiàn)蕾期與初花期)、150 d(成熟期)，每個(gè)小區(qū)取0.5 m2內(nèi)的全部植株，稱取鮮重，測量株高，烘干稱量干重，每個(gè)小區(qū)另取5株苜蓿頂部葉片，用于測定生理指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)測定及方法

株高：每個(gè)小區(qū)測量10株紫花苜蓿植株的自然高度，求平均值。

鮮重：每個(gè)小區(qū)取樣0.5 m2苜蓿后立即稱量鮮重，然后換算成每公頃的產(chǎn)量。

干重：將取回的鮮樣置于105℃烘箱內(nèi)，殺青30 min 后再置于75℃烘箱內(nèi)烘至恒重，稱重。

生理指標(biāo)：另取10 株植株上部同一部位的葉片，葉綠素含量采用乙醇– 丙酮混合提取法[9]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法[10]，脯氨酸含量采用茚三酮法[11]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用四氮唑藍(lán)(NBT)還原法[12]，過氧化氫酶(CAT)活性用紫外線吸收法[13]，過氧化物酶(POD)活性用愈創(chuàng)木酚法[14]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，用Statistix 9對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種植密度和施肥對苜蓿生長和產(chǎn)量的影響

2.1.1 對株高的影響

在各生長時(shí)期施氮量顯著影響苜蓿的株高(P<0.05) (表1)，而種植密度、密度與氮肥的互作效應(yīng)僅在播種后120和150 d 對株高有顯著影響(P< 0.05)。種植密度相同時(shí)，低密度(D1)下，播種后60、90和120 d的株高隨著施氮量的增加而增加；中等密度(D2)下，整個(gè)生育期的株高隨著施氮量的增加先增后減；高密度(D3)下，播種后120和150 d 時(shí)，株高隨著施氮量的增加呈現(xiàn)先增后減趨勢。施氮量相同時(shí)，低氮(N1)下，播種后90 d 時(shí)株高隨著種植密度的增加而增加；中氮(N2)下，播種后90、120和150 d的株高隨著種植密度的增加呈先增后減趨勢；高氮(N3)下，播種后90、120和150 d 的株高隨著種植密度的增加而減少。種植密度和施氮量互作條件下，播種后150 d 時(shí)D2N1和D2N2處理下的株高較高，與D1N1處理相比株高分別增加了18.23%和27.15%。在整個(gè)生育時(shí)期，D2N2互作條件下的株高均高于其他的密度和施肥互作處理(表1)。

表1 不同種植密度和施氮量下紫花苜蓿不同時(shí)期的株高Table 1 Alfalfa plant heights at the different planting densities and nitrogen rates cm

2.1.2 對苜蓿干草產(chǎn)量的影響

種植密度和施氮量對各時(shí)期干草產(chǎn)量的影響均達(dá)極顯著水平(P< 0.01) (表2)，兩者互作在播種后120和150 d 對干草產(chǎn)量影響顯著(P<0.05)。密度不變的條件下，整個(gè)生育期的干草產(chǎn)量在低密度條件下隨著施氮量的增加而增加；中等密度下，所有時(shí)期的干草產(chǎn)量都隨著施氮量的增加先增后減；高密度下，除播種60 d 外，其余時(shí)期的干草產(chǎn)量都隨著施氮量的增加而增加。施氮量相同時(shí)，低氮下，播種后90和150 d 時(shí)，干草產(chǎn)量隨著種植密度的增加而增加；中氮下，整個(gè)時(shí)期的干草產(chǎn)量隨著種植密度的增加呈先增后減趨勢；高氮條件下，播種后90、120和150 d 時(shí)，干草產(chǎn)量則隨著種植密度的增加而增加。種植密度和施氮量互作條件下，播種后150 d時(shí)，D2N2、D3N3處理下干草產(chǎn)量較大，與D1N1處理相比干草產(chǎn)量分別增加了133.2%和84.9%。

表2 不同種植密度和施氮量下紫花苜蓿不同時(shí)期的干草產(chǎn)量Table 2 Alfalfa dry biomass yield at the different planting densities and nitrogen rates kg·hm–2

苜蓿的干草產(chǎn)量隨著生育期的生長而增加，在播種后150 d 達(dá)到最大值。但此時(shí)紫花苜蓿葉片開始減小，含水量降低，營養(yǎng)品質(zhì)以及各項(xiàng)生理特性均有所下降，對紫花苜蓿的飼草品質(zhì)有很大的影響。因此，若將紫花苜蓿作為干草飼料收獲，最適宜的時(shí)期是在播種后的120 d 左右，此時(shí)紫花苜蓿正處于現(xiàn)蕾期和初花期，也是最適合收獲的時(shí)期。

2.2 種植密度和施肥對苜蓿生理生化特性的影響

2.2.1 對丙二醛含量的影響

播種后60 d 時(shí)，苜蓿MDA 含量相對較低，播種后90 d 時(shí)，含量最高(圖1)。種植密度相同時(shí)，低密度下，播種后60和90 d 時(shí)，MDA 的含量受施氮量影響較小；播種120 d、中高密度下，MDA 含量隨著施氮量的增加呈先減后增的趨勢。當(dāng)施氮量相同時(shí)，低氮條件下，播種后60和90 d 時(shí)，MDA 含量隨著密度的增加而減少；高氮條件下，播種120 d 時(shí)，MDA 含量隨著種植密度的增加而增加。兩者互作條件下，播種90 d MDA 含量最高，在D1N3處理下達(dá)到最大，播種后120 d 時(shí)，在D3N1處理下MDA 含量達(dá)到最大，最小值出現(xiàn)在D3N2組合。

圖1 不同種植密度和施氮量下丙二醛的含量Figure 1 Malondialdehyde (MDA)content at the different planting densitiesand nitrogen rates

2.2.2 對脯氨酸含量的影響

隨著生育期的推進(jìn)，紫花苜蓿葉片中脯氨酸含量逐漸增加，在播種后120 d 時(shí)的D2N2組合下達(dá)到最大，為932.3μg·g?1(圖2)。種植密度相同時(shí)，低密度下，播種后90和120 d 時(shí)，苜蓿葉片脯氨酸含量隨施氮量增加先減后增；中等密度時(shí)，整個(gè)時(shí)期脯氨酸的含量隨施氮量增加而先增后減，最大值均出現(xiàn)在D2N2組合；高密度下，播種后90和120 d 時(shí)，苜蓿葉片脯氨酸含量也隨著施氮量增加呈現(xiàn)先減后增的趨勢。施氮量相同條件下，低氮(N1)播種后120 d 時(shí)脯氨酸含量隨著密度增加而增加；中氮(N2)條件下，整個(gè)生育期脯氨酸含量隨著密度增加先增大后減??；高氮(N3)條件下，在播種后60和90 d時(shí)，葉片內(nèi)脯氨酸含量也隨著密度增加而先增后減。在種植密度和施氮量互作條件下，播種后60 d，葉片內(nèi)脯氨酸含量差異不顯著(P>0.05)，播種后90和120 d，D2N2處理的脯氨酸含量明顯高于其他處理。在播種后120 d 時(shí)，D2N2和D3N3處理下脯氨酸含量較高，與D1N1處理相比脯氨酸含量分別增加了24.3%和21.6%。

圖2 不同種植密度和施氮量下脯氨酸的含量Figure2 Prolinecontent at thedifferent planting densitiesand nitrogen rates

2.2.3 對超氧化物歧化酶活性的影響

隨著生長時(shí)間的推移，紫花苜蓿葉片內(nèi)SOD活性逐漸降低，播后60 d 時(shí)D2N2組合下達(dá)到最高值1650.5 U·g?1(圖3)。種植密度相同時(shí)，低密度下施氮量對SOD活性的影響不明顯；中密度下，SOD活性隨施氮量增加呈先增后減；高密度下，播種后90和120 d時(shí)，SOD活性隨著施氮量的增加先減少后增加。施氮量相同時(shí)，SOD活性隨著密度增加而先增后減。

圖3 不同種植密度和施氮量下超氧化物歧化酶的活性Figure 3 Superoxide dismutase (SOD)activity at the different planting densities and nitrogen rates

2.2.4 對過氧化物酶活性的影響

隨著生長時(shí)間的推移，紫花苜蓿葉片內(nèi)POD活性先增加后減少，播后90 d 時(shí)D3N3處理下的POD活性達(dá)到最高，為324.7 U·(g·min)–1。低密度和高密度處理下，播后60和90 d 時(shí)，POD活性隨著施氮量增加而增加。中密度下，POD活性隨著施氮量增加呈先增后減趨勢。施氮量相同時(shí)，中氮處理下，紫花苜蓿葉片POD活性隨著密度增加先增后減。整個(gè)生育期在種植密度和施氮量互作條件下，高密度和高施氮量(D3N3)處理下的POD活性均高于其他處理。播后120 d，D1N2和D2N2處理下POD活性最高，與D1N1處理相比分別增加了43.7%和53.9%(圖4)。

圖4 不同種植密度和施氮量下過氧化物酶的活性Figure 4 Peroxidase dismutase (POD)activity at the different planting densities and nitrogen rates

2.2.5 對過氧化氫酶活性的影響

隨著生長時(shí)間的推移，苜蓿CAT 活性的變化趨勢是播種后90 d > 播種后60 d > 播種后120 d (圖5)。低密度下，播后90 d 時(shí)，CAT 活性隨著施氮量增加而增加；中高密度下，CAT 活性隨著施氮量增加先增后減。施氮量相同時(shí)，中氮和高氮下，播種后60和90 d 時(shí)，CAT活性隨著密度增加先增后減；播種后120 d 時(shí)，密度對CAT 的活性幾乎沒有影響。種植密度和施氮量互作條件下，3個(gè)時(shí)期CAT 活性均在中密度下最大，播后60 d 時(shí)，D2N2處理下CAT 活性較D1N1處理增加了124.7%；播后90 d 時(shí)，D2N2處理下CAT活性較D1N1處理增加了62.8%；播后120 d 時(shí)，D2N2處理下CAT活性較D1N1處理增加了82.1%。

圖5 不同種植密度和施氮量下過氧化氫酶的活性Figure 5 Catalase (CAT)activity at the different planting densities and nitrogen rates

3 討論與結(jié)論

3.1 種植密度和施氮量對紫花苜蓿生長和產(chǎn)量的影響

種植密度是影響作物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的關(guān)鍵因素[15]。密度過小時(shí)，雖然單株所獲得的土壤養(yǎng)分增加，光合面積和時(shí)間也增加，但由于單位面積群體小，導(dǎo)致產(chǎn)量較低[16]。密度過大時(shí)，單株所吸收的養(yǎng)分減少，受到的光照也減少，同樣不利于產(chǎn)量的提高[17]。本研究結(jié)果表明，紫花苜蓿的株高在中低氮下隨著密度的增加呈先增后減趨勢，在中密度(D2)下最高，說明中密度(D2)最利于試驗(yàn)地紫花苜蓿株高的增加。高氮(N3)水平下，株高則隨著密度的增加而減少，說明施氮量和種植密度互作時(shí)，高氮水平下種植密度越高，紫花苜蓿株高越小。干草產(chǎn)量隨著密度的增加先增加后減少，因此，中密度(D2)有利于鹽堿地紫花苜蓿產(chǎn)量的提高，種植密度過高或過低都不利于鹽堿地紫花苜蓿產(chǎn)量的提高，這與孟凱等[18]的研究結(jié)果相同。

氮是植物體內(nèi)許多重要有機(jī)化合物的組成成分，蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素、酶、維生素、生物堿和一些激素都含有氮元素[19]。植物體內(nèi)的各項(xiàng)生命活動，如光合作用、細(xì)胞增長分裂和遺傳變異等均有氮的參與。因此，氮對植物的生命活動、產(chǎn)量的形成與品質(zhì)的優(yōu)劣有著極為重要的作用。有研究表明，施氮后，紫花苜蓿的株高、單株分枝數(shù)和干重均顯著增加[20]，但是施氮量過高不利于紫花苜蓿粗蛋白含量的增加，也不利于粗纖維含量的降低[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，增加施氮量有利于堿地紫花苜蓿的株高和干草產(chǎn)量的增加。種植密度和氮肥互作條件下，中等度(D2)水平下，施氮量過高又不利于鹽堿地紫花苜蓿的產(chǎn)量的提高。

紫花苜蓿的最佳收獲時(shí)期是現(xiàn)蕾期至初花期，綜合種植密度和施氮量互作對株高、干草產(chǎn)量以及飼草品質(zhì)的影響，結(jié)合前人研究，對于江蘇沿海鹽堿地來說，中等密度和中等施氮量互作條件下，播種后120 d左右割刈，此時(shí)苜蓿的粗蛋白含量較其他時(shí)期高，粗纖維和木質(zhì)素等含量較其他時(shí)期含量低，相對飼草價(jià)值較高，同時(shí)也是紫花苜蓿的最佳收獲時(shí)期，最適合作為飼草收割，此時(shí)干草產(chǎn)量最高產(chǎn)量可以達(dá)到11 057.2 kg hm–2[22-23]。

3.2 種植密度和施氮量對紫花苜蓿生理特性的影響

MDA 是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，會導(dǎo)致膜損傷的加劇，MDA 含量可以表征膜脂過氧化的程度和膜系統(tǒng)的受損程度，因此是植物衰老生理和抗逆性生理研究中的常用指標(biāo)[24-25]。本研究結(jié)果表明，高密度種植不利于MDA 含量的降低，降低密度可以降低MDA 含量。播種后90和120 d 時(shí)，低氮(N1)條件下MDA 含量最大，說明增施氮肥可以降低MDA 含量。

脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，脯氨酸除了作為植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外，還在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢等方面起重要作用。植物體內(nèi)的脯氨酸含量越高，則代表植物的抗逆性越強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，脯氨酸含量隨著種植密度的增加先增后減，說明中密度(D2)可以提高植物葉片內(nèi)脯氨酸的含量，高密度(D3)則會導(dǎo)致葉片內(nèi)脯氨酸含量的降低。氮肥對苜蓿葉片內(nèi)脯氨酸含量的影響各有不同，但整體來看，增施氮肥能提高葉片內(nèi)脯氨酸的含量。在種植密度和施氮量互作條件下，播后60 d 葉片內(nèi)脯氨酸含量沒有明顯區(qū)別，播后120和150 d，D2N2處理下，葉片內(nèi)脯氨酸的含量要明顯高于其他處理，說明種植密度和施氮量互作條件下，中密度下施氮有利于提高鹽堿地紫花苜蓿的抗逆性。

活性氧(ROS)的形成是氧正常代謝的天然副產(chǎn)物，并且在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和體內(nèi)平衡中具有重要作用，一般來說，植物體內(nèi)的活性氧可以自我清除，不會危害到植物本身[26]。然而在環(huán)境壓力下(如干旱，鹽度和寒冷等)，ROS水平會急劇增加并對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重危害?？寡趸窼OD、CAT、POD等可以清除過多的ROS，以維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和功能性[27]。不同種植密度下，冬小麥(Triticum aestivum)開花后旗葉SOD和POD活性都隨密度的增加而下降[28]。玉米(Zea mays)生育后期穩(wěn)位葉POD、CAT和SOD的活性隨著施氮量的增加逐漸增加，MDA含量則隨著施氮量的增加而減少[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，種植密度對CAT活性的影響不明顯，SOD活性隨著種植密度的增加先增后減。POD活性隨著密度增加先增后減，在中等密度下(D2)活性較高。中等(N2)和高施氮量(N3)均能顯著的提高了SOD、CAT和POD的活性，說明了適當(dāng)增加種植密度或者增加氮肥量可以清除由于鹽分脅迫紫花苜蓿體內(nèi)的過量ROS，提高鹽堿地紫花苜蓿的抗逆性，緩解鹽分對紫花苜蓿的脅迫。