解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7對(duì)采后臍橙綠霉病的防治作用及機(jī)制

閻 然，傅茂潤(rùn)，陳蕾蕾，李有媛，徐敏慧,3，何志平*，周慶新,*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東 濟(jì)南 250100；3.諸城一中慈海學(xué)校，山東 諸城 262201；4.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300）

臍橙味甜、清香，經(jīng)常食用有抗癌、養(yǎng)顏等功效。臍橙果實(shí)在世界范圍內(nèi)廣泛種植，我國(guó)是世界上臍橙種植面積最大的國(guó)家[1]。臍橙在采后運(yùn)輸以及貯藏過程中，極易受到病原微生物侵染而腐爛。指狀青霉（Penicillium digitatum）是侵染柑橘類果實(shí)而使其發(fā)生綠霉病的主要真菌[2]。此前，防治臍橙綠霉病的方式主要以化學(xué)殺菌劑為主，例如多菌靈、咪鮮胺等[3]。然而，過量使用化學(xué)殺菌劑加之其自身固有的缺點(diǎn)，在使用過程中易產(chǎn)生環(huán)境污染、人畜中毒、農(nóng)藥殘留以及病菌抗藥性等一系列問題。因此，利用具有對(duì)人畜和環(huán)境安全、不受設(shè)備條件限制、操作簡(jiǎn)單、易推廣等特點(diǎn)的生物拮抗劑來防治臍橙綠霉病應(yīng)運(yùn)而生[4-5]。

解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌具有較高親緣性的革蘭氏陽性菌，存在于自土壤、水、空氣等環(huán)境中[6]。由于其產(chǎn)孢量高、存活能力強(qiáng)、理化性質(zhì)穩(wěn)定，被認(rèn)為是一種有潛力的生防菌[7]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛地使用解淀粉芽孢桿菌來抑制由采后病原菌所引起的侵染性病害，例如櫻桃的褐腐病[8]、蘋果的火疫病[9]、獼猴桃的灰霉病[10]。解淀粉芽孢桿菌可分泌較多高活性的抗菌物質(zhì)，主要為抑菌蛋白、脂肽類、氨基酸類以及聚酮化合物等[11]。解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7是分離自姜田土壤的一株廣譜拮抗菌株，對(duì)造成采后果蔬品質(zhì)劣變的多種致病真菌具有良好的抑制作用[12]。本課題組前期研究結(jié)果表明解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7對(duì)于葡萄灰霉病具有良好的抑制效果[13]。然而，其作為拮抗菌來抑制采后臍橙綠霉病的相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)主要探討NCPSJ7對(duì)臍橙果實(shí)指狀青霉的防治效果，分析臍橙體內(nèi)、外的抗菌作用以及潛在抑菌機(jī)制，以期對(duì)解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7在果蔬采后病害防治中的應(yīng)用提供指導(dǎo)意見。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臍橙為市售臍橙，解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所提供；指狀青霉由中國(guó)科學(xué)院植物研究所提供；NCPSJ7的培養(yǎng)和保存使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（nutrient broth，NB）；指狀青霉的培養(yǎng)、保存使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）。

愈創(chuàng)木酚 上海源葉生物科技有限公司；乙二胺四乙酸 上海展云化工有限公司；聚乙烯吡咯烷酮、冰醋酸、次氯酸鈉 上海麥克林生化科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海市申安醫(yī)療器械廠；SPX-250生化培養(yǎng)箱 浙江省托普儀器有限公司；YP電子天平 余姚市金諾天平儀器有限公司；BCD-316WGVP海信冰箱 北京市海信電器有限公司；UB100i生物顯微鏡 重慶市澳浦光電技術(shù)有限公司；HNY-200B生物搖床 天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NCPSJ7發(fā)酵原液的制備

將NCPSJ7接種在NB平板上，33.8 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落接種于NB液體培養(yǎng)基中，在33.8 ℃、152 r/min條件下培養(yǎng)18 h，即得NCPSJ7發(fā)酵原液。使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使用含有0.01%（體積分?jǐn)?shù)，后同）吐溫-80的無菌水稀釋得到不同菌體濃度的發(fā)酵原液。

1.3.2 指狀青霉孢子懸浮液的制備

將指狀青霉接種于PDA平板，28 ℃下恒溫培養(yǎng)5 d。刮取適量產(chǎn)孢菌絲放入裝有適量無菌水及玻璃珠的10 mL離心管中，漩渦振蕩10 s，經(jīng)兩層無菌紗布過濾掉菌絲體得孢子懸浮液[14]。使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用含有0.01%吐溫-80的無菌水稀釋得到1×104CFU/mL的病原菌孢子懸浮液。

1.3.3 不同濃度NCPSJ7對(duì)指狀青霉的抑菌效果的分析

取100 μL 1×104CFU/mL孢子懸浮液加到PDA平板（直徑為90 mm）上并進(jìn)行反復(fù)涂布。涂布30 min后，每個(gè)平板中央放入1 個(gè)牛津杯，分別添加200 μL呈梯度稀釋的NCPSJ7發(fā)酵原液（0、1×105、1×106、1×107、5×107、1×108CFU/mL），28 ℃下培養(yǎng)4 d，觀察抑菌情況并測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.4 指狀青霉孢子萌發(fā)和芽管長(zhǎng)度的測(cè)定

將100 μL不同濃度的NCPSJ7培養(yǎng)液（0、1×107、2.5×107、5×107、7.5×107、1×108CFU/mL）加入到裝含有5 mL液體馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）的試管中，同時(shí)向試管中加入100 μL 1×104CFU/mL的指狀青霉孢子懸浮液，在25 ℃的條件下，搖床（50 r/min）培養(yǎng)15 h，進(jìn)行顯微鏡觀察，在400 倍下用顯微測(cè)微尺測(cè)量指狀青霉孢子的芽管長(zhǎng)度，按式（1）計(jì)算指狀青霉孢子的萌發(fā)率，每組至少觀察200 個(gè)孢子。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3 次。

1.3.5 指狀青霉菌絲形態(tài)的觀察

參照產(chǎn)祝龍[15]的方法并加以改進(jìn)，對(duì)指狀青霉菌絲形態(tài)進(jìn)行觀察。取培養(yǎng)2 d的指狀青霉菌餅倒置放于PDA平板中央，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，在新長(zhǎng)出的菌絲邊緣滴加20 μL 1.0×107CFU/mL NCPSJ7培養(yǎng)液，于28 ℃下培養(yǎng)2 d，用鋒利的薄片刀片將帶有兩種微生物的培養(yǎng)基切成小塊，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液固定24 h后，轉(zhuǎn)移到體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液中靜置12 h。然后依次在體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、乙酸異戊酯、乙醇-乙酸異戊酯（體積比為3∶1）、乙醇-乙酸異戊酯（體積比為1∶1）、乙醇-乙酸異戊酯（體積比為1∶3）和乙酸異戊酯中進(jìn)行的脫水處理（每級(jí)脫水時(shí)間為15 min）。脫水完畢后，常溫下干燥5 d。將處理好的樣品塊用雙面交粘到金屬臺(tái)上，用離子濺射儀鍍金并在掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.3.6 臍橙果實(shí)的發(fā)病率和腐爛指數(shù)測(cè)定

將96 個(gè)臍橙分為0、1×108、2×108、3×108CFU/mL組，每組4 筐，每筐6 個(gè)臍橙。用滅菌后的鋼釘在臍橙赤道位置對(duì)稱刺2 個(gè)直徑3 mm、深度3 mm的孔，室溫下放置20 min，各組分別加入20 μL無菌水和不同濃度的NCPSJ7發(fā)酵原液，室溫放置20 h后注入10 μL 104CFU/mL指狀青霉孢子懸浮液。放入用次氯酸鈉溶液處理食用筐中，聚乙烯保鮮袋密封，在25 ℃條件下貯藏6 d，按式（2）計(jì)算貯藏第4、5、6天時(shí)果實(shí)發(fā)病率，在貯藏第6天拍照觀察果實(shí)表面發(fā)病情況，采用十字交叉法測(cè)量病斑直徑并按式（3）計(jì)算果實(shí)腐爛指數(shù)。

按照果實(shí)腐爛部分占總果實(shí)的面積將果實(shí)分為0～4級(jí)，其中，0級(jí)果實(shí)未腐爛、1級(jí)果實(shí)腐爛面積比例為1%～25%、2級(jí)果實(shí)腐爛面積比例為26%～50%、3級(jí)果實(shí)腐爛面積比例為51%～75%、4級(jí)果實(shí)腐爛面積比例為76%～100%。

1.3.7 NCPSJ7在臍橙果實(shí)傷口處的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)

參照朱瑞瑜[16]的方法并稍作改動(dòng)。用滅菌鋼釘在臍橙赤道位置對(duì)稱刺2 個(gè)直徑3 mm、深度3 mm的孔，注入20 μL 3×108CFU/mL的NCPSJ7發(fā)酵原液，室溫干燥后，放入用次氯酸鈉溶液處理的食用筐中，聚乙烯保鮮袋密封，25 ℃下持續(xù)觀察。利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孔內(nèi)NCPSJ7數(shù)（實(shí)驗(yàn)中NCPSJ7完全滲入橙皮組織時(shí)作為0 h），連續(xù)觀察3 d。傷口內(nèi)NCPSJ7的獲取方法：將1 mL無菌水分多次注入傷口內(nèi)，用移液槍不斷吸打，最終獲得NCPSJ7懸浮液。每個(gè)處理由兩個(gè)臍橙組成，共3 個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。

1.3.8 臍橙果實(shí)相關(guān)代謝酶活力的測(cè)定

用滅菌鋼釘在臍橙赤道位置對(duì)稱刺2 個(gè)直徑3 mm、深度3 mm的孔，根據(jù)不同處理注入濃度為3×108CFU mL的NCPSJ7菌懸液和104CFU/mL指狀青霉孢子懸浮液。CK組：20 μL無菌水；指狀青霉處理組：10 μL指狀青霉孢子懸浮液；NCPSJ7和指狀青霉復(fù)合處理組：先接種20 μL NCPSJ7培養(yǎng)液，20 h后再注入10 μL指狀青霉孢子懸浮液。室溫干燥后，放入用次氯酸鈉溶液處理的食用筐中，在果盤中放入適量無菌水保持濕度，聚乙烯保鮮袋密封，每隔1 d取樣。CK組和復(fù)合處理組取打孔處周圍1 cm的果皮組織，而指狀青霉處理組取病斑周圍1 cm的果皮組織。不同處理取下的組織剪碎，用于臍橙酶活性、抗氧化物質(zhì)含量和能力的測(cè)定。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活力測(cè)定均參照文獻(xiàn)[17]。

1.3.9 臍橙果實(shí)抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化能力的測(cè)定

1.3.9.1 總酚和總黃酮

總酚的測(cè)定采用福林-酚比色法[18]，總黃酮采用分光光度法[19]。總酚含量以沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝0.227 7x-0.248 9，R2＝0.992 7）來計(jì)算，總黃酮以蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝0.489 2x-0.462，R2＝0.993 5）來計(jì)算，單位均為mg/g。

1.3.9.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力和還原力1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力以及還原力的測(cè)定均參照Qu Qingli等[20]的方法，臍橙果實(shí)的DPPH自由基清除能力用DPPH自由基清除率表示，還原力用OD700nm表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 15.0軟件和Excel 2003軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析中的鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的NCPSJ7對(duì)指狀青霉的抑菌效果

在離體實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的NCPSJ7均對(duì)指狀青霉有較為明顯的抑制效果（圖1A），并且抑菌圈的直徑隨著NCPSJ7濃度的升高而顯著增加（P＜0.05）（圖1B），當(dāng)NCPSJ7濃度為1×108CFU/mL時(shí)，抑菌圈直徑為3.50 cm，是1×105CFU/mL NCPSJ7處理組抑菌圈直徑（1.75 cm）的2 倍。由此可知，在一定范圍內(nèi)NCPSJ7濃度越高，抑菌效果越明顯。

圖1 不同濃度的NCPSJ7對(duì)指狀青霉的抑菌活性（A）和抑菌圈直徑（B）的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NCPSJ7 against P.digitatum: antifungal activity (A) and diameter of inhibition zones (B)

2.2 不同濃度NCPSJ7對(duì)指狀青霉孢子萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度的影響

不同濃度NCPSJ7對(duì)指狀青霉孢子萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度的影響如圖2所示，隨著NCPSJ7濃度的升高，指狀青霉孢子萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度均明顯下降。當(dāng)NCPSJ7的濃度從2.5×107CFU/mL增加至5×107CFU/mL時(shí)，指狀青霉的孢子萌發(fā)率由70%下降至24%。當(dāng)NCPSJ7濃度提高至1×108CFU/mL時(shí)，指狀青霉的孢子萌發(fā)率僅為5%（圖2A）。這表明NCPSJ7能明顯抑制指狀青霉孢子的萌發(fā)率，相似地，當(dāng)NCPSJ7菌液濃度為7.5×107CFU/mL時(shí)，指狀青霉的芽管長(zhǎng)度為2.01 μm，而NCPSJ7濃度提高至1×108CFU/mL時(shí)，指狀青霉的芽管長(zhǎng)度僅為0.6 μm，較NCPSJ7菌液濃度為7.5×107CFU/mL時(shí)減小了約70%（圖2B）。由此可見，NCPSJ7也能明顯抑制指狀青霉芽管長(zhǎng)度的增加。

圖2 不同濃度NCPSJ7對(duì)指狀青霉孢子萌發(fā)率（A）和芽管長(zhǎng)度（B）的影響Fig.2 Effects of different concentrations of NCPSJ7 on spore germination (A) and germ tube length (B) in P.digitatum

2.3 NCPSJ7對(duì)指狀青霉菌絲形態(tài)的影響

由圖3A可知，指狀青霉菌絲表面光滑，菌絲數(shù)量多。而加入NCPSJ7后，大量的拮抗菌附著于指狀青霉菌絲的表面，使菌絲無法正常生長(zhǎng)，出現(xiàn)表面粗糙、菌絲稀疏的現(xiàn)象（圖3B）。

圖3 掃描電子顯微鏡下觀察NCPSJ7對(duì)指狀青霉菌絲的影響Fig.3 Effects of NCPSJ7 on the mycelium of P.digitatum under scanning electron microscope

2.4 NCPSJ7在臍橙傷口處的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)

如圖4所示，NCPSJ7可在24 h時(shí)快速定植在臍橙表面的傷口處，且在48 h達(dá)到峰值，之后趨于平穩(wěn)。這表明NCPSJ7能較長(zhǎng)時(shí)間存在于植物體內(nèi)，對(duì)植物產(chǎn)生持續(xù)性保護(hù)，可更好地延長(zhǎng)果實(shí)的貨架期。同時(shí)這也證明NCPSJ7能夠搶占指狀青霉生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)和空間。

圖4 NCPSJ7在臍橙傷口處的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)Fig.4 Growth curve of NCPSJ7 in wounds in oranges

2.5 不同濃度NCPSJ7和指狀青霉在臍橙上的互作效果

不同濃度NCPSJ7和指狀青霉在臍橙上的互作效果如圖5所示。與0 CFU/mL NCPSJ7組相比，不同濃度的NCPSJ7均使臍橙的發(fā)病數(shù)量和發(fā)病的嚴(yán)重程度明顯降低。并且隨著NCPSJ7濃度的不斷增加，效果更為明顯。

圖5 不同濃度NCPSJ7和指狀青霉在臍橙上的互作效果Fig.5 Inhibitory effect of different concentrations of NCPSJ7 on navel oranges inoculated with P.digitatum

2.6 不同濃度NCPSJ7對(duì)臍橙果實(shí)發(fā)病率、病斑直徑和腐爛率的影響

如圖6所示，隨著NCPSJ7濃度的增加，臍橙果實(shí)的發(fā)病率、腐爛指數(shù)以及病斑直徑均呈下降趨勢(shì)。其中當(dāng)貯藏時(shí)間相同時(shí)，3×108CFU/mL NCPSJ7處理組果實(shí)發(fā)病率顯著低于其他處理組（P＜0.05）（圖6A）。這表明NCPSJ7能明顯抑制果實(shí)的發(fā)病率，且高濃度NCPSJ7效果更好。相似地，臍橙經(jīng)過3×108CFU/mL NCPSJ7處理后，果實(shí)的腐爛指數(shù)和病斑直徑均顯著低于其他處理組（P＜0.05）（圖6B、C）。

圖6 不同濃度NCPSJ7對(duì)臍橙發(fā)病率（A）、腐爛指數(shù)（B）和病斑直徑（C）的影響Fig.6 Effects of different concentrations of NCPSJ7 on decay incidence (A), decay index (B) and lesion diameter (C) in orange fruit inoculated with P.digitatum

2.7 NCPSJ7對(duì)臍橙果實(shí)抗病相關(guān)酶活力的影響

如圖7A所示，臍橙在貯藏0～4 d時(shí)，復(fù)合處理處理組果實(shí)內(nèi)PPO活力高于指狀青霉組和CK組，說明NCPSJ7主要在果實(shí)貯藏的前期對(duì)PPO的活性產(chǎn)生積極影響。如圖7B所示，臍橙果實(shí)在貯藏第1天時(shí)，復(fù)合處理處理組的POD活力為201.67 U/gmf，顯著高于CK組和指狀青霉處理組（P＜0.05）。如圖7C、D所示，復(fù)合處理組果實(shí)的CHI和GLU活性在貯藏第4天顯著高于CK組和指狀青霉處理組（P＜0.05）。

圖7 3×108 CFU/mL NCPSJ7對(duì)臍橙果實(shí)抗病相關(guān)酶活性的影響Fig.7 Effect of 3 × 108 CFU/mL NCPSJ7 on defense-related enzyme activities in inoculated navel oranges

2.8 NCPSJ7對(duì)臍橙果實(shí)抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化能力的影響

如圖8所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，臍橙果實(shí)的抗氧化物質(zhì)（總酚和總黃酮）含量和抗氧化能力（DPPH自由基清除能力和還原力）均不斷升高。從圖8A可以看出，指狀青霉單一處理組和CK組的總酚含量分別在貯藏第3天和第4天均呈現(xiàn)不同程度的下降，而復(fù)合處理處理組在果實(shí)貯藏至第5天時(shí)仍處于上升的狀態(tài)。在貯藏至第5天時(shí)，復(fù)合處理果實(shí)中總酚含量為1.57 mg/g，分別是對(duì)照處理（1.08 mg/g）和單一處理（1.30 mg/g）的1.45 倍和1.21 倍。果實(shí)中的總黃酮含量在不同的處理組中出現(xiàn)峰值的時(shí)間有所差異。指狀青霉單一處理在貯藏第3天出現(xiàn)峰值，而對(duì)照組和復(fù)合處理組出現(xiàn)峰值的時(shí)間分別為第4天和第5天（圖8B）。從圖8C、D中可以看出，在貯藏中后期（第4～6天），復(fù)合處理處理組果實(shí)中DPPH由基清除能力和還原力均顯著高于指狀青霉處理組和CK組（P＜0.05）。

圖8 3×108 CFU/mL NCPSJ7對(duì)臍橙果實(shí)抗氧化物質(zhì)含量和能力的影響Fig.8 Effect of 3 × 108 CFU/mL NCPSJ7 on bioactive substance contents and antioxidant capacity in inoculated navel oranges

3 討 論

真菌病原體一旦附著于果實(shí)表皮，可通過果實(shí)自身的傷口和氣孔獲取營(yíng)養(yǎng)，這可能刺激其孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)，從而造成嚴(yán)重的采后病害[21]。體外研究發(fā)現(xiàn)，NCPSJ7可以顯著抑制指狀青霉的孢子萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度，并且對(duì)于NCPSJ7的濃度具有一定的依賴性，即抑菌效果隨NCPSJ7的濃度增大而增強(qiáng)，且體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。這在Zhu Huimin等[22]的研究中得到證實(shí)，其認(rèn)為高濃度的拮抗酵母Yarrowia lipolytica可以顯著抑制指狀青霉和意大利青霉孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)，且體內(nèi)外抑制效果均直接取決于NCPSJ7的濃度。

生物拮抗過程中一種重要機(jī)制為拮抗菌通過競(jìng)爭(zhēng)空間和營(yíng)養(yǎng)來抑制致病菌的生長(zhǎng)繁殖。Zhang Xuehua等[23]將Bacillus amyloliquefaciensCMN1308應(yīng)用于防治板栗采后病害中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)根霉、腐皮鐮刀菌、葡萄穗霉屬、青霉菌和黑曲霉等致病菌表現(xiàn)出了極強(qiáng)的空間和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)研究了NCPSJ7在臍橙傷口處的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)NCPSJ7可在24 h快速定植在果實(shí)傷口處，48 h到達(dá)頂峰，隨后保持穩(wěn)定狀態(tài)。電子顯微鏡觀察的結(jié)果表明，NCPSJ7生長(zhǎng)較為密集的區(qū)域，指狀青霉的菌絲表面粗糙且數(shù)量較少，推測(cè)原因?yàn)镹CPSJ7通過搶奪空間和營(yíng)養(yǎng)來抑制指狀青霉的生長(zhǎng)。

當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，在啟動(dòng)自我防御的早期階段會(huì)出現(xiàn)活性氧的爆發(fā)，導(dǎo)致大量過氧化氫、超氧陰離子等中間體在植物細(xì)胞積累并造成傷害。因此，植物中存在著大量的抗氧化酶以防御氧化脅迫[24]。POD、PPO可參與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞活性氧代謝過程并使其處于動(dòng)態(tài)平衡之中。此外，二者均參與宿主植物細(xì)胞的木質(zhì)化過程，是引起病原菌侵染防御反應(yīng)的關(guān)鍵酶。鄭香香等[25]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌通過在杏果實(shí)貯藏的前中期誘導(dǎo)PPO的POD活性增加來提高果實(shí)的抗病性，起到保鮮效果。Zhu Huimin等[22]的研究表明拮抗酵母可在柑橘果實(shí)貯藏前期和中期誘導(dǎo)PPO和POD活性到達(dá)峰值，其活性的升高與果實(shí)病害的下降呈正相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)NCPSJ7在果實(shí)貯藏前中期可以誘導(dǎo)PPO活性的增加并且顯著而快速的誘導(dǎo)POD活性高峰的出現(xiàn)。CHI和GLU是植物系統(tǒng)獲得抗病性的標(biāo)志，可水解致病菌細(xì)胞膜中幾丁質(zhì)和葡聚糖，通過破壞原生質(zhì)膜將其殺死[26]。且GLU和CHI會(huì)協(xié)同作用于病原微生物細(xì)胞膜的降解[27]。拮抗菌B.amyloliquefaciensMG-3接種于枇杷后可誘導(dǎo)產(chǎn)生GLU和CHI，從而提高對(duì)炭疽病菌的抗性和降低果實(shí)的發(fā)病率和褐變度[28]。與之類似的作用結(jié)果在荔枝[29]、櫻桃番茄[24]、柑橘[22]、葡萄柚[30]等果實(shí)均有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)NCPSJ7可在臍橙果實(shí)貯藏后期可協(xié)同誘導(dǎo)GLU和CHI的活性提高。以上結(jié)果表明果實(shí)的抗病性可通過拮抗菌誘導(dǎo)防御酶活性的升高來獲得。

酚類物質(zhì)氧化形成的醌類物質(zhì)是潛在的抗病因子，因此酚類物質(zhì)具有直接抗病性[31]，同時(shí)也具有一定的抗氧化性。本研究結(jié)果表明，總酚、總黃酮的含量在果實(shí)貯藏前中期呈不斷上升的變化趨勢(shì)并且指狀青霉處理組顯著高于對(duì)照組和復(fù)合處理處理組，推測(cè)原因?yàn)橹笭钋嗝固幚斫M的臍橙病變程度更高，果實(shí)在高病害侵染條件下所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。該現(xiàn)象與酚類物質(zhì)在病原菌入侵后含量升高并參與抵抗龍眼的擬莖點(diǎn)霉菌[32]、草莓的灰霉菌[33]相一致。另外，總酚、總黃酮在復(fù)合處理處理組中隨著果實(shí)貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷積累，從而在果實(shí)貯藏后期表現(xiàn)出更強(qiáng)大地防御病害侵染的能力。當(dāng)果實(shí)遭到病原菌入侵或自身細(xì)胞衰老等因素出現(xiàn)時(shí)，自由基生成過多或清除能力減弱會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，進(jìn)而使細(xì)胞失去防御能力[34]。相比于指狀青霉單一處理和CK組，復(fù)合處理處理組的臍橙果實(shí)在貯藏中期顯著提高DPPH自由基清除能力和還原力，并且能不斷提高直至貯藏結(jié)束。這可能是由于NCPSJ7的存在能減輕指狀青霉對(duì)果實(shí)的損害，保護(hù)果實(shí)中總酚、黃酮等有機(jī)自由基清除劑，促進(jìn)POD和PPO活性增強(qiáng)，進(jìn)而使果實(shí)總體抗氧化能力得到提升。這或許也是解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7抑制綠霉病發(fā)生的機(jī)理之一。

解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7能顯著降低指狀青霉的發(fā)病率、病斑直徑和腐爛指數(shù)。NCPSJ7對(duì)指狀青霉的作用機(jī)制主要包括以下3 個(gè)方面：1）NCPSJ7可以迅速定植在臍橙傷口內(nèi)部，通過競(jìng)爭(zhēng)空間和營(yíng)養(yǎng)來抑制指狀青霉菌絲的生長(zhǎng)；2）NCPSJ7誘導(dǎo)抗性相關(guān)酶PPO、POD、CHI和GLU活性增加，從而增強(qiáng)果實(shí)對(duì)指狀青霉的抵抗能力；3）NCPSJ7提高了臍橙總酚、總黃酮含量以及DPPH自由基的清除能力和還原力，增加了果實(shí)的抗氧化能力以抑制臍橙綠霉病的發(fā)生。綜上，解淀粉菌NCPSJ7可作為一種有效抑制臍橙果實(shí)綠霉病的生物拮抗劑。