黑塞石蜈蚣屬一新種(石蜈蚣目：石蜈蚣科)及分子系統(tǒng)學(xué)分析

盧艷敏， 裴素儉， 劉海鵬， 馬惠欽*

(1. 衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院多足動物研究所，河北衡水053000；2. 河北省濕地生態(tài)與保護(hù)重點實驗室(籌)，河北衡水053000)

黑塞石蜈蚣屬Hessebius由Verhoeff于1941年建立，但Verhoeff并未指定模式種，該屬包括來自土耳其的H.kosswigiVerhoeff, 1941和H.tauricusVerhoeff, 1941，后者被Zapparoli(1999)移入石蜈蚣屬Lithobius。Pei等(2010)選擇H.kosswigiVerhoeff, 1941作為模式種，并對該屬的特征進(jìn)行了重新描述。目前，全世界黑塞石蜈蚣屬已知13種(Bonatoetal.，2016)，中國有7種(Verhoeff，1942；Maetal.，2009，2018；Peietal.，2010；Qiaoetal.，2018，2019)，主要鑒別特征為：觸角多為20節(jié)，單眼每側(cè)13～15個，顎足基胸板具2+2齒，背板后角無三角形突起，第14和15對步足比其他步足粗，基節(jié)腺孔4～7個；雌性生殖肢第1節(jié)具 2+2 個生殖棘，第2節(jié)背側(cè)末端向后方突起，第3節(jié)末端具爪，有時基部具齒。分布范圍從蒙古、中國中西部到中亞、烏拉爾南部、俄羅斯西南部、向西至中東和東地中海盆地(Peietal.，2010)。在鏡檢采自甘肅省的石蜈蚣標(biāo)本時，發(fā)現(xiàn)黑塞石蜈蚣屬一新種冰突石蜈蚣Hessebiustranslucidussp. nov.，本文對新種的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了詳細(xì)描述，主要鑒別特征進(jìn)行了顯微拍照，并基于COⅠ基因開展了分子系統(tǒng)發(fā)育分析，以證明該新種的判定和分類地位正確無誤。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集、制備與觀察

標(biāo)本采自落葉層或石塊下面，保存于75%乙醇中。利用裝備了測微尺和Axiocam 512 Color的 Zeiss SteREO Discovery V20體視顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。顏色描述以75%乙醇浸泡的標(biāo)本為準(zhǔn)，體長是指頭板前緣到最后背板后緣的距離。本文使用的解剖學(xué)術(shù)語依據(jù)Bonato等(2010)的總結(jié)。形態(tài)測量數(shù)據(jù)單位為mm。觀察標(biāo)本保存于衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院多足動物研究所。

1.2 分子系統(tǒng)學(xué)分析

1.2.1 DNA的提取、PCR擴增和測序分別取保存于95%乙醇中的6頭標(biāo)本(-20 ℃)兩側(cè)歩足，使用TIANamp血液/組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取總DNA。PCR擴增使用引物為LCO1490(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)和HCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)(Folmeretal.，1994)，擴增的COⅠ片段為650 bp，該引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×PCR mix(abm)12.5 μL，LCO1490(10 μmol·L-1)/HCO2198(10 μmol·L-1)各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，44 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將條帶清晰的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司雙向測序。使用seqman對雙向測序結(jié)果進(jìn)行拼接，然后以Fasta格式輸出。

1.2.2 分子系統(tǒng)學(xué)分析以Lamyctesemarginatus和Anopsobiusneozelanicus為外群，用MEGA7.0中的Muscle (Edgar，2004)進(jìn)行序列比對，并基于K2P模型進(jìn)行遺傳距離分析。使用ModelFinder(Kalyaanamoorthyetal.，2017)選擇最適替代模型；用MrBayes構(gòu)建Bayesian系統(tǒng)發(fā)育樹，最適模型為GTR+F+I+G4。所用序列均來源于GenBank(表1)。

表1 本文所用物種基因序列的登錄號Table 1 GenBank accession numbers of the gene sequences

1.3 形態(tài)術(shù)語縮寫詞

C. 基節(jié)(coxa)，F(xiàn). 腿節(jié)(femur)，P. 前腿節(jié)(prefemur)，S. 腹板(sternite)，T. 背板(tergite)，Ti. 脛節(jié)(tibia)，Tr. 轉(zhuǎn)節(jié)(trochanter)，a. 前(anterior)，m. 中(median)，p. 后(posterior)。

2 結(jié)果

2.1 冰突石蜈蚣，新種(圖版Ⅰ)

模式標(biāo)本：正?！?，體長24.5，頭長2.1，頭寬2.4。甘肅省定西市安定區(qū)西巖山森林公園(104.612 761°E，35.585 469°N，1 901 m)，2018年8月24日，馬惠欽、裴素儉采；副模52♀♀，49♂♂，采集信息同正模。用于分子系統(tǒng)學(xué)分析的6個樣本均來自副模，所有標(biāo)本保存于衡水學(xué)院多足動物研究所標(biāo)本室。

詞源學(xué)：新種種名源自拉丁名“translucidus”，意指雌性生殖肢第2節(jié)背側(cè)末端的突起像冰一樣透明。

鑒別特征：新種近似于甘肅明突石蜈蚣H.luculentus(Maetal.，2018)，但可以通過下列特征來區(qū)別：1)新種雌性生殖肢第2節(jié)背側(cè)具有5～7個刺，而后者具有9個較細(xì)刺；2)新種雌性生殖肢第3節(jié)末端爪腹側(cè)具有明顯的較大刺狀突起，而后者為小齒狀突起；3)新種第10對步足前腿節(jié)背側(cè)無中刺，后者具有中刺；4)新種第12、13對步足腿節(jié)背側(cè)無前刺，而后者具有前刺。

描述：體長16.8～27.7，頭長1.6～2.2，頭寬1.6～2.4。

顏色：觸角基部各節(jié)黃褐色，略帶紅色。背板淡黃褐色，有的個體略帶紅色，頭板、第15背板顏色稍深。體側(cè)淡灰色。腹面淡黃褐色。顎足末端棕紅色，顎足其他部分、基胸板、第15節(jié)腹板以及生殖節(jié)腹板黃褐色略帶紅色。第1～13對步足淡黃褐色，第14、15對步足黃褐色，各步足跗節(jié)黃褐色。

觸角：18～22節(jié)，多數(shù)為20+20節(jié)，少數(shù)為19+20節(jié)和20+21節(jié)，個別為20+22節(jié)和 18+20 節(jié)。基部長寬近相等，末節(jié)長為寬的2.3～3.2倍。剛毛數(shù)量由基部向遠(yuǎn)端逐漸增多，從第5、6節(jié)開始，剛毛密度不再改變。

頭板：光滑，具有光澤，具細(xì)密網(wǎng)紋，額溝明顯。頭寬略大于頭長。頭殼側(cè)緣起于單眼群與頭板后緣中間，后緣全緣且平直，表面、側(cè)緣及后緣著生稀疏、長短不一的剛毛。

單眼和托氏器：單眼9～14個，近似橢圓形，約為3列排布。單眼半透明狀，眼底具黑色素。近背側(cè)單眼較大，近腹側(cè)單眼較小，最后一個單眼最大，托氏器橢圓形到圓形，位于單眼群前下方，比鄰近單眼小。

基胸板：近似梯形，齒緣窄，外側(cè)齒比內(nèi)側(cè)齒稍靠前。兩側(cè)向腹側(cè)隆起，中央縱溝明顯。前緣具2+2齒，三角形，稍小，基部寬，末端尖。副齒稍粗，位于最外齒外側(cè)肩部腹側(cè)，基部有較弱突起?；匕逯醒氚忌?，呈“V”形。齒緣附近著生長短不一的剛毛，向后數(shù)量逐漸減少。

背板和腹板：各背板光滑，具有光澤，具細(xì)密網(wǎng)紋。TT1、3、5后緣全緣，TT7、8、10、12、14后緣不連續(xù)。各背板側(cè)緣、后緣及其附近著生稀疏、長短不一的剛毛。TT8、10和12后緣微凹，T14后緣前凹。各腹板前寬后窄，近似倒梯形，表面光滑，有光澤。從S1開始，逐漸增大，SS8～12近似相等，SS13～15逐漸減小，表面上著生長短不一的剛毛。

步足：第1～13對步足跗節(jié)的分節(jié)不太明顯，第14、15對步足跗節(jié)的分節(jié)明顯。步足各節(jié)表面具長短不一的剛毛，第1～13對步足第一跗節(jié)腹側(cè)中部有1列整齊排列的剛毛，第二跗節(jié)腹側(cè)中部有 2列排列整齊的剛毛。第14、15對步足比前邊步足粗而且長，跗節(jié)剛毛數(shù)量少于其他步足，跗節(jié)腹側(cè)沒有整齊排列的剛毛。所有步足跗節(jié)末端均具彎向腹側(cè)的爪，第1～14對步足主爪具前后2副爪，前側(cè)稍細(xì)較長，后側(cè)稍粗。后副爪與主爪的角度稍大。第15對步足不具副爪。第15對步足第二跗節(jié)為跗節(jié)總長度的36%～40%，第二跗節(jié)長是寬的4.3～4.8倍。步足刺式見表2和表3。

表2 冰突石蜈蚣，新種Hessebius translucidus sp. nov. 雌性個體步足刺式Table 2 Leg plectrotaxy of female Hessebius translucidus sp. nov.

基節(jié)腺孔：4～7個，步足腹側(cè)的基節(jié)腺孔排列方式多數(shù)為5-6-6-6(少見4-6-6-7)。基節(jié)腺孔橢圓形、近似圓形，大小相似，排成1列。基節(jié)腺孔區(qū)凹陷較淺，邊緣隆起。

雌性：第15節(jié)腹板前寬后窄，近似倒梯形。前后角均圓，后緣中部平直。生殖節(jié)腹板長大于寬，角質(zhì)化程度比較高。腹板后緣在兩生殖肢間的中部向前和向背部凹陷，在中央有一小的近似圓錐形突起，角質(zhì)化程度較高，向背方傾斜，生殖節(jié)腹板兩側(cè)向背部極度傾斜。生殖節(jié)腹板表面著生稀疏、長短不一的剛毛，近后緣及兩側(cè)剛毛稍多且長。生殖肢分為 3節(jié)，第1節(jié)比較寬大，表面密布長短不一的剛毛，且后外側(cè)剛毛長于內(nèi)側(cè)；內(nèi)側(cè)著生2+2個圓錐形生殖棘，內(nèi)側(cè)較小，稍靠前，外側(cè)較大，稍靠后。第2節(jié)腹面上著生4～9根剛毛，約成3排；背側(cè)具5～7個刺，末端向后方突起，突起向后延伸形成透明結(jié)構(gòu)，側(cè)面觀近三角形。第3節(jié)腹面上著生2～3根剛毛，約成1排；末端具爪，爪不分裂，向腹側(cè)彎曲，末端較寬闊，在爪基部腹側(cè)有一刺狀突起。

雄性：第15節(jié)腹板前寬后窄，近似倒梯形，后緣平直，兩后角圓。生殖節(jié)腹板稍小于雌性，常較好角質(zhì)化。生殖節(jié)腹板表面密布長短不一剛毛，位于近后緣處的剛毛較長，排列整齊。后緣中部向前和向背部具有淺的凹陷，凹陷的中部無突起。生殖肢短小，僅為2個較小的半球形突起，頂端角質(zhì)化，其上著生2～6根剛毛。

2.2 分子系統(tǒng)學(xué)結(jié)果

COⅠ基因保守在系統(tǒng)發(fā)育研究中具有重要意義，可以用來推斷物種間的親緣關(guān)系。使用MrBayes 3.2.6構(gòu)建了BI系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，該系統(tǒng)樹包括新種的6個個體、2個黑塞石蜈蚣屬物種、19個石蜈蚣科Lithobiidae其他屬物種，2種單眼石蜈蚣科Henicopidae物種作為外群。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，本文新種6個個體集中于一支，位于黑塞石蜈蚣屬，支持率為100%，H.prospinosa與本文新種親緣關(guān)系較近。新種與石蜈蚣科其他種匯為一支，分類地位明確。

本文新種不同個體間的遺傳距離為0～2.2%，小于10%，因此認(rèn)為是同一種。與Hessebiusprospinosas的平均遺傳距離為10%，與Hessebiusruoergaiensis的平均遺傳距離為15.6%，可認(rèn)為是不同種。新種與Hessebiusprospinosas的遺傳距離最小(10%)，而Lithobiusvariegatusrubriceps與Lamyctesemarginatus的遺傳距離最大(29.4%)，石蜈蚣科內(nèi)不同種與外群的遺傳距離為20.3%～29.4%(附錄)。

3 討論

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明冰突石蜈蚣與H.prospinosa的遺傳距離為10%，親緣關(guān)系較近；形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)該種與明突石蜈蚣、H.prospinosa形態(tài)上相似，但均有4條不同的特征，結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果，冰突石蜈蚣為黑塞石蜈蚣屬一新種，分類地位明確。石蜈蚣目所含屬種內(nèi)遺傳距離一般小于10%，種間遺傳距離大于10%(Qiaoetal.，2018)。同一屬內(nèi)形態(tài)相似物種，基因也有高度的相似性，在系統(tǒng)發(fā)育樹中會聚在一起(St Clair & Visick，2013)。