白花敗醬草提取物對人結(jié)直腸癌細胞SW480增殖和凋亡的影響

黃芳芳， 張雙喜， 郜志誠， 朱粟意， 張相安*

(1.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院肛腸科，河南 鄭州 450000)

結(jié)直腸癌是一類消化道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，該病發(fā)病率正逐年上升[1]。外科手術(shù)、放療和化療仍是目前治療結(jié)直腸癌的主要手段。臨床上常用的化療藥物會引起機體產(chǎn)生較大的不良反應(yīng)，給患者造成嚴重的危害[2-3]。因此尋求新的治療藥物或方法在癌癥的治療和預(yù)后中顯得尤為重要。采用無毒高效的中藥用于癌癥的治療已受到廣大學者的廣泛關(guān)注[4]。白花敗醬草PatriniavillosaJuss是一種敗醬科草本植物，具有清熱解毒、活血化瘀、利尿排膿、鎮(zhèn)心安神等功效，臨床上常用于胃腸炎等疾病的治療[5]，其抗癌作用的研究日益增多[6]。通過白花敗醬草對小鼠黑素瘤B16細胞、人乳腺癌MCF-7細胞、人宮頸癌Hela細胞和小鼠淋巴細胞白血病細胞L1210干預(yù)的研究發(fā)現(xiàn)，白花敗醬草可能通過抑制CDK4和cyclin D1的表達，阻滯細胞周期G0/G1期，減少S期細胞數(shù)量，最終導致增殖抑制作用，誘導細胞凋亡，起到抗腫瘤作用[7]。Notch信號通路參與正常細胞及癌細胞增殖、分化、凋亡等多種過程，且與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[8-9]。目前研究顯示白花敗醬草對結(jié)直腸癌細胞具有抑制作用[10-11]，但其是否通過調(diào)控Notch信號通路起到抗癌作用的研究鮮有報道。本實驗通過白花敗醬草干預(yù)人結(jié)直腸癌SW480細胞，觀察其對SW480細胞增殖、凋亡及Notch信號通路的影響，探討其作用機制，為白花敗醬草臨床上用于結(jié)直腸癌的治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 白花敗醬草購自河南中醫(yī)藥大學，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院張相安教授鑒定為敗醬科敗醬屬類植物白花敗醬草PatriniavillosaJuss，選取部位為根部。順鉑注射液購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司(批號20171003)。人結(jié)直腸癌細胞株SW480購自美國ATCC細胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司(批號20161205)；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司(批號20171123)；胰蛋白酶購自美國HyClone公司(批號20170812)；噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)購自美國Sigma公司(批號20170916)；二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide，DMSO)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號20170625)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司(批號20170811)。Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)抗體(批號20170816)、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase-3)(批號20170820)抗體、辣根酶標記的二抗(批號20170715)均購自美國Santa Cruz公司；BCA蛋白定量試劑盒(批號20170816)、ECL發(fā)光檢測試劑盒(批號20170913)、SYBR Green Gene Expression Assay(批號20161021)購自寶生物工程(大連)有限公司；RNA提取試劑盒(批號20170611)、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號20161124)購自美國Thermo公司。

1.2 白花敗醬草水提液的制備 取100 g白花敗醬草進行粉碎處理，用蒸餾水(10倍體積)浸泡3 h，煮沸提取收集藥液，藥渣再次煮沸后收集藥液，合并兩次收集的藥液，經(jīng)減壓濃縮，真空干燥后，得到白花敗醬草提取物干粉，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥理藥效實驗中心鑒定含有總皂莢61.82%、總黃酮8.71%，保存在4 ℃冰箱中，使用時以完全培養(yǎng)基稀釋成所需質(zhì)量濃度。

1.3 細胞培養(yǎng) 人結(jié)直腸癌SW480細胞復(fù)蘇后，以RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)重懸，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀態(tài)更換新鮮培養(yǎng)基，待細胞生長匯合度至80%時，用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代，細胞傳至2～3代后用于后續(xù)實驗。

1.4 MTT法檢測細胞增殖情況 將處于對數(shù)期的SW480細胞接種于96孔板中，接種密度為每孔5×104個，置于37 ℃常規(guī)培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，貼壁后加不同質(zhì)量濃度白花敗醬草提取物進行干預(yù)。將細胞分為空白對照組、白花敗醬草治療組(終質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2 mg/mL)[11]和順鉑組(終質(zhì)量濃度為5 μg/mL)，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。于24、48、72 h后，每孔細胞中加入20 μL MTT溶液，孵育4 h后棄上清，再分別向細胞中加入100 μL二甲基亞砜，置震蕩儀上混勻，待沉淀完全溶解后，酶標儀490 nm處檢測每組細胞光密度值(OD值)，計算各組細胞增殖抑制率，公式為細胞增殖抑制率=(1-實驗組細胞OD值/對照組細胞OD值)×100%。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取空白對照組和白花敗醬草治療組(質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2 mg/mL)以及順鉑組細胞，相應(yīng)處理后48 h終止培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化收集細胞，分別制成單細胞懸液，將待測細胞濃度調(diào)整為5×105個/mL。取1 mL上述細胞懸液，4 ℃、1 000 r/min離心10 min，去上清，以結(jié)合緩沖液懸浮細胞，加入5 μL碘化丙啶(PI)輕輕混勻，再加入5 μL膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)避光室溫反應(yīng)15 min，流式細胞儀上機檢測各組細胞凋亡情況。

1.6 Western blot檢測細胞中cleaved caspase-3、Bax蛋白表達 將對數(shù)期SW480細胞接種于培養(yǎng)皿中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，換液后加入終質(zhì)量濃度為0、0.5、1、2 mg/mL的白花敗醬草提取物，順鉑組加入終質(zhì)量濃度為5 μg/mL的順鉑藥液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細胞，分別加入蛋白裂解液，提取細胞中可溶性蛋白，采用BCA試劑盒定量后，加入上樣緩沖液，在沸水中水浴10 min變性，取質(zhì)量為120 μg變性蛋白，以10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，待所有條帶均勻分開后停止電泳。采用半干法將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉4 h，分別加入cleaved caspase-3一抗(1∶500稀釋)、Bax(1∶1 000稀釋)進行雜交，置搖床上4 ℃過夜孵育，以TBS洗膜3次，每次10 min，加入二抗(1∶1 500稀釋)進行雜交，室溫孵育2 h，以TBS洗滌3次后ECL化學發(fā)光，成像儀中曝光拍照，采用凝膠成像系統(tǒng)分析各條帶，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，統(tǒng)計cleaved caspase-3、Bax蛋白相對表達。

1.7 RT-qPCR檢測細胞中Notch1、Hes-1 mRNA表達 按照上述處理方法，用0、0.5、1、2 mg/mL的白花敗醬草提取物干預(yù)SW480細胞48 h后，順鉑組以終質(zhì)量濃度為5 μg/mL的藥液干預(yù)細胞48 h，按照RNA提取試劑盒提取各組細胞中RNA，用RNase-free ddH2O溶解RNA，經(jīng)質(zhì)量濃度和純度檢測后，以合格的RNA為模板采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用SYBR Green Gene Expression Assay進行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后分析熔鏈曲線，確定無非特異性擴增，以GAPDH為內(nèi)參，用相對定量2-△△CT計算各組細胞中Notch1、Hes-1 mRNA表達量。GAPDH正向引物5′-GTCATCCATGACAACTTTGG-3′，反向引物5′-GAGCTTG ACAAAGTGGTCGT-3′；Nocth1正向引物5′-GCGGCTCACGG TCTCACTC-3′；反向引物5′-TCCGCGGCTCCATC GTCTACC-3′；Hes-1正向引物 5′-ACGTGCGAGGG GCGTTAATA-3′，反向引物5′-GGGGTAGGTCATGGCAT TGA-3′。

2 結(jié)果

2.1 白花敗醬草對SW480細胞增殖的影響 經(jīng)0、0.5、1、2 mg/mL 白花敗醬草提取物干預(yù)SW480細胞24、48、72 h后，MTT法檢測對細胞增殖的影響，結(jié)果如表1所示，可知隨著白花敗醬草提取物質(zhì)量濃度的增加，細胞增殖抑制率隨之升高(P<0.05)。

表1 不同質(zhì)量濃度的白花敗醬草對SW480細胞增殖的影響

2.2 白花敗醬草對SW480細胞凋亡的影響 用0、0.5、1、2 mg/mL 白花敗醬草提取物處理SW480細胞48 h后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡，結(jié)果如圖1和表2所示，與空白對照(0 mg/mL)組比較，0.5、1、2 mg/mL組細胞凋亡率升高(P<0.05)；與0.5 mg/mL組比較，1、2 mg/mL組細胞凋亡率升高(P<0.05)；與1 mg/mL組比較，2 mg/mL組細胞凋亡率升高(P<0.05)。

圖1 流式細胞檢測各組細胞凋亡情況

表2 白花敗醬草對SW480細胞凋亡的影響

2.3 白花敗醬草對SW480細胞中cleaved caspase-3、Bax蛋白表達的影響 Western blot檢測結(jié)果如圖2和表3所示，與空白對照(0 mg/mL)組比較，0.5、1、2 mg/mL組cleaved caspase-3和Bax蛋白表達升高(P<0.05)；與0.5 mg/mL組比較，1、2 mg/mL組cleaved caspase-3和Bax蛋白表達升高(P<0.05)；與1 mg/mL組比較，2 mg/mL組cleaved caspase-3和Bax蛋白表達升高(P<0.05)。

圖2 Western blot檢測SW480細胞中cleaved caspase-3和Bax蛋白表達

表3 白花敗醬草對SW480細胞中cleaved caspase-3和Bax蛋白表達的影響

2.4 白花敗醬草對SW480細胞中Notch1、Hes-1 mRNA表達的影響 如表4所示，與空白對照(0 mg/mL)組比較，0.5、1、2 mg/mL組Notch1、Hes-1 mRNA表達降低(P<0.05)；與0.5 mg/mL組比較，1、2 mg/mL組Notch1、Hes-1 mRNA表達降低(P<0.05)；與1 mg/mL組比較，2 mg/mL組Notch1、Hes-1 mRNA表達降低(P<0.05)。

表4 白花敗醬草對SW480細胞中Notch1、Hes-1基因表達的影響

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)白花敗醬草對多種腫瘤細胞具有明顯抑制作用。白花敗醬草廣泛應(yīng)用于消化、呼吸、血液等惡 性腫瘤的治療，且在大腸癌的治療中取得較好治療效果[12]。人宮頸癌Hela細胞體外研究中，白花敗醬草通過激活凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3，誘導Hela細胞凋亡，發(fā)揮抗宮頸癌作用[13]。在人胃癌、肝癌細胞中有同樣的發(fā)現(xiàn)，白花敗醬草通過活化caspase-3抑制細胞生長[14-15]。目前治療腫瘤研究中誘導腫瘤細胞凋亡成為了新的熱點。細胞凋亡是受多種基因調(diào)控，具有典型的形態(tài)和生化特征的一種生物學行為，且受天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspases)家族和Bcl-2家族基因調(diào)控[16]。caspases能夠參與細胞生長、分化、細胞因子成熟及細胞凋亡，其中caspase-3是凋亡通路中關(guān)鍵效應(yīng)分子，是細胞凋亡的執(zhí)行者[17]。Bcl-2家族中的Bax基因是一種促凋亡基因，其過表達可促使細胞趨于死亡[18]。本實驗結(jié)果顯示，白花敗醬草能夠抑制人結(jié)直腸癌SW480細胞的增殖，隨著白花敗醬草質(zhì)量濃度的增高，抑制作用增強；通過流式細胞儀檢測，白花敗醬草可誘導SW480細胞凋亡，同樣呈質(zhì)量濃度依賴效應(yīng)。此外本實驗還通過Western blot檢測細胞中cleaved caspase-3和Bax表達變化，發(fā)現(xiàn)白花敗醬草干預(yù)SW480細胞后兩者表達升高，白花敗醬草可誘導caspase-3激活，促進Bax表達，間接使SW480細胞發(fā)生凋亡。以上結(jié)果表明白花敗醬草通過抑制結(jié)直腸癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

在加味薏苡附子敗醬散對肝癌細胞株Bel-7404的影響實驗中，發(fā)現(xiàn)含藥血清可通過下調(diào)Notch信號通路及靶基因抑制Bel-7404細胞增殖[19]。Notch信號通路參與細胞之間信息傳遞及細胞生長、分化等過程，是細胞信號網(wǎng)絡(luò)的重要通路[20]。近年來研究表明，Notch信號通路的激活可促進腫瘤干細胞增殖導致腸腫瘤的形成[21]。Notch信號通路中關(guān)鍵效應(yīng)分子Notch1在結(jié)直腸瘤中高表達，能夠阻斷結(jié)直腸黏膜杯細胞的終末分化，促使未分化的細胞向惡性轉(zhuǎn)化，發(fā)揮致癌作用[22]。體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)過表達Notch1可顯著促進結(jié)直腸癌細胞的集落形成、增殖及腫塊生成[23]。本實驗通過白花敗醬草對SW480細胞干預(yù)后，檢測Notch信號通路效應(yīng)分子Notch1基因及靶基因Hes-1的表達，顯示Notch1、Hes-1 mRNA表達降低，提示白花敗醬草可抑制Notch信號通路的激活。

本研究使用白花敗醬草提取物對結(jié)直腸癌細胞體外干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其對結(jié)直腸癌細胞體外增殖抑制作用明顯，表現(xiàn)出一定的質(zhì)量濃度和時間依賴關(guān)系；且能夠誘導結(jié)直腸癌細胞凋亡，上調(diào)與凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達，激活caspase-3。白花敗醬草提取物可降低Notch1及Hes-1 mRNA表達，影響Notch信號通路的激活，達到抑制結(jié)直腸癌細胞的作用。白花敗醬草能否在體內(nèi)抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移需進行進一步臨床實驗研究。中藥白花敗醬草提取物對結(jié)直腸癌細胞中信號通路的影響將為治療結(jié)直腸癌提供新的作用靶點及思路。