生物可降解鎂對(duì)人膽管癌細(xì)胞和小鼠H22腫瘤抑制作用研究

李 天， 劉 沖， 何金瞳， 張丹陽(yáng)， 隋凱達(dá)， 張洲博， 邵海波

原發(fā)性肝膽腫瘤包括肝細(xì)胞癌和膽管癌，肝細(xì)胞癌可能以腫瘤壓迫、瘤栓形成、彌漫性腫瘤浸潤(rùn)等方式累及膽道［1］，引起膽道狹窄或阻塞，而膽管癌晚期也可引起膽管狹窄和梗阻［2］。膽道支架植入術(shù)已成為緩解晚期梗阻性黃疸、延長(zhǎng)患者生存期的有效方法［3］。然而膽道支架植入術(shù)后再狹窄率超過50%［4］，主要由腫瘤侵入導(dǎo)致，相當(dāng)多患者需要再次干預(yù)［5］。傳統(tǒng)膽道支架材料為鈦合金，在體內(nèi)不能降解，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。近年來(lái)具有可降解性質(zhì)的金屬鎂以良好的力學(xué)性能和生物相容性、較高的生物活性和可降解性顯示出巨大的應(yīng)用潛力，已成為生物醫(yī)用材料領(lǐng)域研究熱點(diǎn)［6］。鎂金屬作為植入醫(yī)療器械材料在骨折內(nèi)固定［7］，骨組織多孔支架和心血管支架［8-9］，食管良性狹窄藥物鎂合金支架及胃腸外科手術(shù)［10-11］中均得到廣泛研究或應(yīng)用。有研究證明，金屬鎂在降解過程中可抑制骨肉瘤、口腔表皮樣癌等腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［12-14］。為探討可降解金屬鎂應(yīng)用于膽道支架材料解決腫瘤侵入支架所致膽道支架再狹窄的可行性，本研究利用人膽管癌細(xì)胞觀察鎂降解引起的細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡，采用H22荷瘤小鼠模型觀察純鎂在腫瘤組織中的生物降解過程及其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 樣品制備和材料表征

實(shí)驗(yàn)所用金屬材料由中國(guó)科學(xué)院金屬研究所制備并提供，鑄態(tài)純鎂純度為99.95%，擠壓成型，選擇鈦合金（Ti6AL4V）作為陰性對(duì)照，培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)前將樣品打磨至2.5 μm級(jí)，用丙酮和無(wú)水乙醇超聲清洗，紫外線正反兩面照射30 min消毒待用；金屬片用于提取浸提液，尺寸為10 mm×15 mm，按可降解材料表面積/浸提介質(zhì)為1.25 cm2/mL比例，加入含10%胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco公司）細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃恒溫箱中浸提，分別于第1、3、5天檢測(cè)各組浸提液pH值。金屬絲直徑1.5 mm，長(zhǎng)度10 mm，用于體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系為人膽管癌細(xì)胞（RBE），由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供。用90%不完全RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司）、10%FBS配置細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)基。

1.3 鎂體外抑制腫瘤實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞毒性 采用細(xì)胞抑制率（%）作為細(xì)胞膜完整性指標(biāo)，并作為細(xì)胞毒性一般指標(biāo)。將RBE細(xì)胞（100 μL）分配在96孔板（2×103個(gè)細(xì)胞/孔）并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后處理。棄掉培養(yǎng)液后，實(shí)驗(yàn)組分別在每孔加入純鎂和鈦合金于第1、3、5天的浸提液200 μL，空白對(duì)照組加入相同體積培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，棄去各孔培養(yǎng)液，向每孔加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)基及10 mL細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK）-8溶液（上海碧云天生物技術(shù)公司），放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h后用酶標(biāo)儀OD490 nm處檢測(cè)各孔吸光值。計(jì)算各組細(xì)胞抑制率（%），即抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組/空白對(duì)照組）×100%。

1.3.2 細(xì)胞凋亡 采用膜聯(lián)蛋白（annexin）Ⅴ-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）雙染試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）檢測(cè)RBE細(xì)胞凋亡率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入純鎂和鈦合金第1、3、5天浸提液，空白對(duì)照組加入相同體積培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）胰酶消化收集細(xì)胞，冷的磷酸緩沖液（PBS）洗滌離心細(xì)胞2次，加入100 μL 1×結(jié)合緩沖液（binding buffer）后置細(xì)胞懸液于流式管內(nèi)，分別向各組中相應(yīng)加入annexinⅤ-FITC和PI各5 μL，避光孵育15 min，最后每管加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，震蕩后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算凋亡率后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 體內(nèi)抑制腫瘤實(shí)驗(yàn)

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)范》。

1.4.1 體內(nèi)抑制腫瘤作用 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選用近交系Balb/c小鼠，皮下腫瘤最長(zhǎng)徑約0.8 cm時(shí)入組。隨機(jī)分為純鎂組和鈦合金組，每組20只。所有手術(shù)器械經(jīng)高壓蒸汽法滅菌，手術(shù)臺(tái)乙醇消毒，小鼠以1%戊巴比妥鈉按50 mg/kg劑量腹腔注射麻醉；切開小鼠皮膚，暴露腫瘤組織，金屬絲橫穿腫瘤組織；縫合傷口，繼續(xù)飼養(yǎng)。在第3、6、9、12、15天分別測(cè)量每組小鼠腫瘤最長(zhǎng)徑和最短徑（n=6），處死每組3只小鼠，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。根據(jù)Steel公式計(jì)算腫瘤體積，即體積＝（短徑2×長(zhǎng)徑）/2（mm3）。

1.4.2 體內(nèi)金屬降解 在第3、6、9、12、15天處死小鼠，依次將小鼠俯臥于檢查臺(tái)上，進(jìn)行鉬靶X線攝影（曝光條件：28 kV，18 mAs），監(jiān)測(cè)體內(nèi)金屬降解情況。

1.4.3 組織病理學(xué)分析 術(shù)后第15天，腫瘤組織以4%多聚甲醛固定2周，石蠟包埋，切片，制備腫瘤切片進(jìn)行組織病理學(xué)分析。常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，免疫組織化學(xué)染色。經(jīng)脫蠟、脫水、修復(fù)、滅活和阻斷后，組織切片分別與低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α（1∶100）一抗和碳酸酐酶（CA）Ⅸ（1∶500）一抗（英國(guó)Abcam公司）在4℃孵育過夜。二抗孵育后，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)材料周圍腫瘤細(xì)胞凋亡情況。最后在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩組間同一時(shí)間點(diǎn)比較用兩樣本t檢驗(yàn)，3組數(shù)據(jù)比較用方差分析和Bonferroni兩兩均數(shù)比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 純鎂浸提時(shí)間對(duì)pH值影響

分別測(cè)定各組第1、3、5天提取液pH值，結(jié)果表明，隨著純鎂浸提天數(shù)增加，浸提液pH值逐漸增加，其各個(gè)時(shí)間點(diǎn)pH值均顯著高于鈦合金浸提液；第5天純鎂浸提液pH值最高可達(dá)到11.0，而鈦合金浸提液pH值最高則維持在8.6，見圖1。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)各組對(duì)應(yīng)pH值

2.2 純鎂浸提液對(duì)RBE細(xì)胞增殖影響

CCK-8試驗(yàn)結(jié)果表明，第1、3、5天純鎂浸提液均抑制RBE細(xì)胞增殖（P＜0.05），且呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性。第1、3、5天純鎂浸提液對(duì)RBE細(xì)胞抑制率分別為24.7%、60.2%、70.7%，而鈦合金浸提液分別為-3.1%、1.3%、1.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)不同材料浸提液對(duì)RBE細(xì)胞毒性的影響

2.3 純鎂浸提液對(duì)RBE細(xì)胞凋亡影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，純解鎂浸提液可誘導(dǎo)RBE細(xì)胞凋亡，隨著浸提時(shí)間延長(zhǎng)和pH值增高，凋亡細(xì)胞百分比相應(yīng)增加。第1、3、5天細(xì)胞凋亡率，純鎂浸提液分別為13.8%、33.8%、46.7%，鈦合金浸提液分別為6.1%、7.1%、5.6%，空白組為4.1%，純鎂組與空白對(duì)照組、鈦合金組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)不同材料浸提液對(duì)RBE細(xì)胞凋亡的影響

2.4 純鎂對(duì)小鼠H22腫瘤生長(zhǎng)的影響

通過對(duì)小鼠腫瘤體積和重量的監(jiān)測(cè)，結(jié)果如圖4所示。隨著時(shí)間增加，植入純鎂金屬絲小鼠腫瘤大小和重量均明顯小于鈦合金金屬絲處理的腫瘤。第9、12、15天，植入鈦合金小鼠腫瘤平均體積分別為11.4 cm3、18.0 cm3、21.7 cm3，而植入純鎂小鼠腫瘤平均體積分別為5.6 cm3、8.2 cm3、11.2 cm3，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。術(shù)后小鼠生存率達(dá)到90%以上，生存時(shí)間可達(dá)25 d；因腫瘤組織過大，對(duì)小鼠實(shí)施安樂死。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)不同材料組小鼠H22腫瘤重量和體積

2.5 純鎂在小鼠H22腫瘤中降解情況

從鉬靶影像（圖5）上可以看到，隨著時(shí)間的推移，傳統(tǒng)鈦合金材料在小鼠體內(nèi)并未發(fā)生明顯變化。與鈦合金相比，純鎂金屬邊緣變得模糊，且在金屬周圍存在少量氣體。

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)不同材料在小鼠H22腫瘤內(nèi)降解情況

2.6 純鎂植入小鼠H22腫瘤后組織病理學(xué)分析

通過術(shù)后第15天腫瘤組織HE染色、TUNEL染色和免疫組織化學(xué)染色，進(jìn)一步證明純鎂對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。HE染色上可看到植入純鎂的材料周圍腫瘤細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核消失。TUNEL染色凋亡細(xì)胞標(biāo)記為棕色，純鎂組凋亡細(xì)胞比率為平均9.7%，而鈦合金組為5.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；免疫組化染色結(jié)果顯示，植入純鎂小鼠腫瘤組織CAⅨ蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），其上游蛋白HIF-1α也有下降，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 不同材料對(duì)小鼠H22細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的影響（×100）

3 討論

支架內(nèi)再狹窄已成為目前影響惡性梗阻性黃疸膽道支架植入術(shù)后療效和預(yù)后的主要原因，盡管再狹窄原因中良、惡性因素混雜，但惡性腫瘤生長(zhǎng)仍然是影響支架遠(yuǎn)期通暢率和患者預(yù)后的主要因素［15］，尤其是肝細(xì)胞癌、膽管癌呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)趨勢(shì)時(shí)，往往可很快生長(zhǎng)入支架內(nèi)［16］。因此，如何預(yù)防膽道支架植入術(shù)后再狹窄成為臨床研究熱點(diǎn)。目前研究主要集中在支架材料、覆膜支架、光動(dòng)力療法、支架植入術(shù)后聯(lián)合介入治療及放化療［15，17］。生物可降解金屬鎂在降解過程中被證實(shí)具有良好的抗腫瘤性能，但能否抑制肝膽腫瘤尚不清楚。本研究分別采用人膽管癌細(xì)胞和H22荷瘤小鼠模型，旨在體內(nèi)外測(cè)試可降解金屬鎂對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著純鎂浸提天數(shù)增加，其pH值逐漸增加（圖1）；純鎂浸提液對(duì)RBE細(xì)胞毒性與對(duì)照組相比顯著增加，隨著浸提時(shí)間增加，細(xì)胞毒性也越來(lái)越大（圖2）。有研究證明堿性環(huán)境能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，金屬鎂降解時(shí)溶液中主要產(chǎn)物是Mg（OH）2，但溶液中Cl-使Mg（OH）2轉(zhuǎn)換為MgCl2，溶液中OH-增多，導(dǎo)致溶液中pH迅速上升［18］。Witte等［19］研究顯示體內(nèi)外金屬鎂均能顯著增加材料周圍的堿度，從而抑制在此環(huán)境中殘存的腫瘤細(xì)胞。Wang等［13］研究顯示Mg2+濃度在50 mmol/L時(shí)，骨肉瘤U2-OS細(xì)胞于第7天相對(duì)生長(zhǎng)速率（RGR）為98.6%，并無(wú)明顯細(xì)胞毒性，且其在腐蝕介質(zhì)環(huán)境中的主要降解產(chǎn)物為Mg（OH）2。Pompa等［20］研究表明，金屬鎂對(duì)正常小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞（MC3T3-E1）毒性處于理想范圍內(nèi)。因此可推測(cè)純鎂浸提液能抑制RBE增殖，可能與其降解導(dǎo)致浸提液pH上升，改變了腫瘤生長(zhǎng)的酸性環(huán)境有關(guān)。腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡抵抗（resistance to apoptosis）是腫瘤發(fā)生的主要原因之一［21］。本研究進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)體外觀察純鎂對(duì)RBE細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)純鎂浸提液可導(dǎo)致RBE細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞數(shù)隨著浸提天數(shù)增加而增加（圖3），這與前述RBE細(xì)胞CCK-8結(jié)果相一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，純鎂與鈦合金同時(shí)植入小鼠H22皮下腫瘤后第3、6、9、12、15天，純鎂組腫瘤體積增長(zhǎng)更慢（圖4），金屬邊緣變得模糊，周圍有一定的氣體產(chǎn)生（圖5），鉬靶攝影也觀察到體內(nèi)氣體產(chǎn)生。Wang等［13］研究顯示可降解鎂材料降解時(shí)產(chǎn)生氣泡，不利于腫瘤細(xì)胞黏附生長(zhǎng)。CAⅨ是一種缺氧導(dǎo)致高表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白，是HIF-1α下游蛋白，正常組織中幾乎不表達(dá)，而腫瘤組織中呈高表達(dá)。CAⅨ參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，并可使腫瘤細(xì)胞維持周圍微環(huán)境弱酸性，適應(yīng)微環(huán)境變化，促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和對(duì)放療的抵抗［22］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，純鎂組小鼠腫瘤組織中CAⅨ含量較鈦合金組明顯降低，其上游蛋白HIF-1α雖有變化，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6），這也與浸提液中pH值變化相對(duì)應(yīng)。不過還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充證明這一觀點(diǎn)。本研究還觀察到植入純鎂的腫瘤細(xì)胞凋亡率相比鈦合金更高（圖6），進(jìn)一步證實(shí)可降解金屬鎂對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用。

綜上，本研究表明可降解金屬鎂是一種具有選擇性、有潛力抗腫瘤的膽道支架材料。可降解金屬鎂在體內(nèi)腐蝕雖較快，但通過合金化、表面處理和特種加工工藝等方法可有效提升鎂合金材料的耐腐蝕性能，滿足臨床上對(duì)其降解率的要求，且研究證明經(jīng)過微弧氧化處理的純鎂降解速率變慢［23-24］。然而可降解金屬鎂與鈦合金相比對(duì)腫瘤細(xì)胞仍有一定毒性作用［25］。本研究?jī)H探究純鎂與傳統(tǒng)鈦合金相比對(duì)腫瘤的抑制作用，未檢測(cè)其他鎂合金對(duì)腫瘤的抑制作用。Qiao等［26］研究顯示，可降解金屬鎂植入動(dòng)物體內(nèi)腫瘤后對(duì)其他臟器并無(wú)明顯毒性作用。但可降解金屬鎂抑制腫瘤的機(jī)制仍需更多實(shí)驗(yàn)研究加以證明。鎂基金屬材料在抑制腫瘤作用方面，相對(duì)于現(xiàn)有鈦合金材料有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，有望成為一種可行的膽道支架替代材料。