基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究丹參-骨碎補藥對治療股骨頭壞死的作用機(jī)制

陳 中 鄭 陽 仇湘中 張信成 尹晨東

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南長沙 410006；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院骨傷科，湖南長沙 410006

股骨頭壞死是指因各種原因?qū)е鹿晒穷^血供中斷或減少，引起局部骨細(xì)胞缺血、變性、壞死，骨結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致股骨頭塌陷的嚴(yán)重骨關(guān)節(jié)炎[1]。我國股骨頭壞死發(fā)病率逐漸年輕化[2]。洪坤豪等[3]、王丹丹等[4]、黃佳敏等[5]采用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)發(fā)現(xiàn)丹參、骨碎補出現(xiàn)頻率較高，郭會卿、仇湘中等骨傷名家也將丹參、骨碎補作為其治療股骨頭壞死的核心藥對[6-7]。由此可見，丹參-骨碎補藥對在中醫(yī)藥治療股骨頭壞死處方中有重要作用。

1 資料與方法

1.1 丹參-骨碎補藥對的活性成分和靶點的獲取

分別以中藥名“丹參”“骨碎補”在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫下載ingredients、targets；根據(jù)ADME 篩選模型，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18。將獲得的丹參和骨碎補的genesymbol導(dǎo)入UNIPORT 數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 股骨頭壞死相關(guān)靶點的獲取

以“Osteonecrosis of the femoral head ”為關(guān)鍵詞，物種限定為人類，分別在GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫中檢索股骨頭壞死相關(guān)靶點，獲取股骨頭壞死相關(guān)靶點信息。

1.3 丹參-骨碎補藥對與股骨頭壞死相交靶點的獲取

通過R 軟件將丹參-骨碎補藥對相關(guān)潛在靶點與股骨頭壞死的潛在靶點取交集并繪制維恩圖。

1.4 藥物-活性成分-股骨頭壞死靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將丹參-骨碎補藥對活性成分及治療股骨頭壞死潛在靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，選擇Multiple protein，限定物種為人，獲取靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系；利用R軟件，將蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）數(shù)據(jù)導(dǎo)入，得知基因的連接節(jié)點數(shù)，繪制丹參-骨碎補治療股骨頭壞死的關(guān)鍵靶點圖。

1.5 丹參-骨碎補藥對治療股骨頭壞死潛在靶點GO和KEGG 富集分析

將藥物與疾病交集潛在靶點基因運用R 軟件的“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包（Bioconductor），設(shè)定p value Cutoff=0.05，q value Cutoff=0.05對這些潛在作用靶點進(jìn)行KEGG 和GO 功能富集分析，繪制GO 功能富集與KEGG 富集分析氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 丹參-骨碎補藥對活性成分

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選獲得丹參有效活性成分52 個，骨碎補有效活性成分18 個，藥物活性成分包括木犀草素、山柰酚、丹參酮Ⅱ A、柚皮素、β-谷甾醇等70 個。見表1。

表1 丹參-骨碎補藥對有效成分

2.2 丹參-骨碎補藥對治療股骨頭壞死潛在靶點篩選結(jié)果

丹參和骨碎補共獲得158 個潛在靶點；通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Relevance score≥8獲得股骨頭壞死靶點基因590 個，OMIM 數(shù)據(jù)庫獲得68 個，合并之后刪除重復(fù)項獲得不同的股骨頭壞死作用靶點639 個。二者映射得67 個交集靶點。見圖1。

圖1 丹參-骨碎補藥對相關(guān)潛在靶點-股骨頭壞死潛在靶點維恩圖

2.3 丹參-骨碎補藥對治療股骨頭壞死調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運用Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制丹參-骨碎補藥對-股骨頭壞死調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。見圖2。

圖2 丹參-骨碎補治療股骨頭壞死調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 丹參-骨碎補藥對治療股骨頭壞死的靶點基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及核心靶點的篩選

運用STRING 數(shù)據(jù)庫獲取靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系見圖3；將PPI 數(shù)據(jù)導(dǎo)入R 軟件通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)繪制丹參-骨碎補治療股骨頭壞死的關(guān)鍵靶點圖（圖4），圖形越大，關(guān)系越密切，篩選出11 個關(guān)鍵靶點，分別為IL-6、AKT1、TP53、VEGFA、JUN、MAPK8、TNF、MAPK3、PTGS2、CASP3、MAPK1。

圖3 丹參-骨碎補治療-股骨頭壞死靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

圖4 丹參-骨碎補治療股骨頭壞死的關(guān)鍵靶點

2.5 丹參-骨碎補藥對與股骨頭壞死交集靶點的GO和KEGG 富集分析結(jié)果

GO 功能富集顯示靶點分子功能主要涉及炎癥、細(xì)胞代謝、核染色質(zhì)、蛋白質(zhì)、酶、磷酸酶受體結(jié)合等，見圖5；KEGG 通路富集分析獲得163 條通絡(luò)，經(jīng)進(jìn)一步篩選，主要與PI3K-Akt、MAPK、IL-17、癌癥相關(guān)通路相關(guān)，將富集靶點數(shù)最多的前20 條通路繪制成KEGG 功能富集圖，見圖6。KEGG 通路所包含基因分析顯示幾乎每條通路都有核心靶點AKT、VEGFA、TNF、MAPK 的參與。

圖5 丹參-骨碎補治療股骨頭壞死靶點GO 富集

圖6 KEGG 通路富集信息

3 討論

本研究篩選出藥物有效成分包括木犀草素、山柰酚、丹參酮Ⅱ A、柚皮素、β-谷甾醇等。木犀草素能較好的與MMP1、MMP3 結(jié)合并下調(diào)其表達(dá)水平，抑制IL-1、TNF-α 等致炎因子水平從而緩解骨關(guān)節(jié)炎疼痛[12]。山柰酚能夠明顯提高大鼠血清Ca2+、Ⅰ型前膠原羧基端前肽水平、降低Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽含量，促進(jìn)骨膠原生成減少[13]。柚皮素能顯著下調(diào)p-p65 表達(dá)水平從而抑制NF-κB 活性[14]；β-谷甾醇可下調(diào)ERK1/2 和上調(diào)Bcl-2/Bax 水平[15]，Bcl-2/Bax 蛋白在細(xì)胞凋亡信號通路中起十分關(guān)鍵作用[16]。由上可知丹參-骨碎補的有效成分可調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子水平，減少骨細(xì)胞凋亡。

本研究通過GO 分析后推測丹參-骨碎補可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗炎癥因子等過程治療股骨頭壞死，其中尤以細(xì)胞生物學(xué)過程最為重要。KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)4 個核心靶點AKT、VEGFA、TNF、MAPK。AKT 主要存在于靜止細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)，是PI3K 的下游效應(yīng)因子，AKT 可正調(diào)節(jié)NF-κB信號通路，進(jìn)而降低TNF-α、IL-1β 的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡[17-18]；VEGFA 是VEGF 家族的一員，有研究表明[19-21]VEGFA 可上調(diào)VEGF mRNA 表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞可增加miRNA-210 脫甲基化表達(dá)，促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性和分化，丹參酮Ⅱ A 可誘導(dǎo)VEGF 表達(dá)，刺激血管修復(fù)和新血管形成[22-23]，Zhang 等[24]研究發(fā)現(xiàn)VEGF 還可促進(jìn)MSCs 向成骨細(xì)胞分化；因此VEGF 的表達(dá)量可影響股骨頭微循環(huán)和骨組織修復(fù)再生。TNF-α 是由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，TNF-α可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致血管功能紊亂；MAPK 包括p38、JUK、ERK 三條主要信號通路，Ma 等[25]結(jié)果表明p38 通路在TGF-β1 誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化中被激活，TGF-β1 可上調(diào)SOX9、膠原蛋白Ⅱ、聚集蛋白聚糖和GAG 表達(dá)水平，骨形成被抑制。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)[26]JUK1、JUK2 廣泛存在于各種組織中，JUK3僅存在于腦、心臟等，JUK 信號通路被TNF-α 等炎癥因子磷酸化后，炎癥因子的表達(dá)量也相應(yīng)降低，從而發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)炎作用。周毅等[27]研究發(fā)現(xiàn)川骨片上調(diào)SANFH 家兔股骨頭組織ERK1/2 的表達(dá)、抑制JNK、p38 表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成和抑制破骨細(xì)胞的形成，發(fā)揮治療股骨頭壞死作用。