口腔扁平苔蘚患者外周血中ASH1L及其相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)與免疫功能相關(guān)性

王方方 汪 鷹 蔡 揚(yáng)

1.貴州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽 550004；2.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院種植修復(fù)科，四川成都 610000；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，貴州貴陽 550004

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是一種較常見的口腔黏膜慢性炎癥疾病，一般認(rèn)為T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答紊亂在其發(fā)病機(jī)制起重要作用[1-3]。ASH1L是一種組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，可負(fù)向調(diào)控白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6 分泌并參與多種基因的轉(zhuǎn)錄激活[4-5]。泛素編輯酶A20 是一種抗炎蛋白[6]，IL-6 為一種參與免疫反應(yīng)的多功能細(xì)胞因子[7]，兩者在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[8-10]。研究表明ASH1L可誘導(dǎo)活化A20，通過A20 的去泛素化修飾負(fù)向調(diào)控IL-6，保護(hù)機(jī)體抵抗自身免疫性疾病[11-12]。本研究通過分析OLP 患者外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中ASH1L、A20、IL-6 表達(dá)與免疫功能的相關(guān)性，探討其在OLP 免疫發(fā)病機(jī)制中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018 年8 月至2019 年8 月于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的40 例OLP初診患者（OLP 組），其中男14 例，女26 例；年齡18～71 歲，平均（41.6±7.9）歲。另選擇我院同期20 名體檢健康的志愿者（對照組），其中男12 名，女8 名；年齡20～54 歲，平均（37.0±6.4）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：參照《口腔黏膜病學(xué)》[13]OLP 診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合臨床表現(xiàn)和組織病理學(xué)檢查確診為OLP。排除標(biāo)準(zhǔn)：①1～3 個月內(nèi)使用過抗生素、糖皮質(zhì)激素等相關(guān)藥物；②伴有全身免疫系統(tǒng)性疾??；③妊娠及哺乳期女性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，受試者均知情同意。

1.2 檢測方法

反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）、SYBRGreen 熒光定量試劑盒（RR820A）均購自大連寶生物有限公司；美國Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR 儀、美國BD FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成，見表1。抽取兩組空腹靜脈血5 ml，其中2 ml采用散射比濁法檢測體液免疫指標(biāo)，另外3 ml采用乙二胺四乙酸抗凝，分別用于提取PBMC，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析淋巴細(xì)胞亞群百分比。采用實(shí)時熒光定量PCR 進(jìn)行提取總RNA，總RNA 定量及純度檢測后按說明合成cDNA、配制PCR 反應(yīng)體系，設(shè)置反應(yīng)條件：95℃10 min，95℃10 s，60℃15 s，共40 個循環(huán)，采用2-△△Ct 法[14]對各基因進(jìn)行相對定量分析。

表1 基因引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，偏態(tài)分布計量資料的描述以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。計數(shù)資料采用例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞免疫指標(biāo)水平比較

OLP 組中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、總T+B+NK細(xì)胞水平均低于對照組，CD19+、CD4+/CD8+比值均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 兩組細(xì)胞免疫指標(biāo)水平比較（）

表2 兩組細(xì)胞免疫指標(biāo)水平比較（）

注：OLP：口腔扁平苔蘚

2.2 兩組體液免疫指標(biāo)水平比較

OLP 組IgM 水平高于對照組，補(bǔ)體C3、C4 水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 兩組體液免疫指標(biāo)水平比較（mg/L，）

表3 兩組體液免疫指標(biāo)水平比較（mg/L，）

注：OLP：口腔扁平苔蘚

2.3 兩組ASH1L、A20、IL-6 mRNA 相對表達(dá)量比較

OLP 組ASH1L 及A20 mRNA 相對表達(dá)量低于對照組，IL-6 mRNA 高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表4。

表4 兩組ASH1L、A20、IL-6 mRNA 相對表達(dá)量比較[M（P25，P75）]

2.4 OLP 組ASH1L、A20、IL-6 mRNA 相對表達(dá)量與免疫功能指標(biāo)相關(guān)性分析

OLP 組ASH1L mRNA 相對表達(dá)量與IgG 水平呈正相關(guān)（r ＞0，P ＜0.05）。A20 mRNA 相對表達(dá)量與CD8+、IgA 水平呈正相關(guān)（r ＞0，P ＜0.05），與CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)（r ＜0，P ＜0.05）。見表5。

表5 OLP 組ASH1L、A20、IL-6 mRNA 相對表達(dá)量與免疫功能指標(biāo)相關(guān)性分析

3 討論

OLP 是一種以T 細(xì)胞浸潤為特征的自身免疫性疾病[15-17]，ASH1L 為高度保守的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶，通過A20 去泛素化修飾抑制IL-6 表達(dá)，在體內(nèi)具有保護(hù)作用[18-19]。本研究OLP 組PBMC 中ASH1L、A20相對表達(dá)量低于對照組，且二者呈正相關(guān)，提示隨ASH1L 表達(dá)減弱，局部炎癥微環(huán)境持續(xù)活化，其誘導(dǎo)A20 活化的能力下降而導(dǎo)致A20 相對表達(dá)不足，在機(jī)體內(nèi)所發(fā)揮的抗炎作用有限。二者表達(dá)水平下降可能是由于其向OLP 病損部位遷移，血液中相對缺乏表達(dá)ASH1L 與A20 的細(xì)胞，這與OLP 組二者表達(dá)水平下降的結(jié)果相一致[20]。本研究結(jié)果顯示，A20 表達(dá)下調(diào)，與在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病中研究結(jié)果一致[9，21]。本研究提示ASH1L 表達(dá)水平下調(diào)、抑炎作用減弱時，IL-6 水平升高，OLP 炎癥程度隨之加重。IL-6 表達(dá)水平升高，提示PBMC 可能是OLP 患者血清IL-6 來源，反映了OLP 患者機(jī)體慢性炎癥狀態(tài)。研究[22-24]發(fā)現(xiàn)IL-6 過度合成可參與自身免疫性疾病發(fā)展過程，可作為檢測疾病活動的生物標(biāo)志物。OLP組中A20 的表達(dá)水平與CD8+、IgA 呈正相關(guān)，與CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)，推測A20 的表達(dá)下降與CD8+向局部病損組織遷移有關(guān)，A20 可能通過影響T 細(xì)胞功能參與OLP 特應(yīng)性免疫應(yīng)答過程。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)ASH1L 及相關(guān)調(diào)控因子在OLP 患者外周血PBMC 中表達(dá)異常且與免疫指標(biāo)有關(guān)，在OLP 免疫發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了一定作用。