載阿霉素上轉(zhuǎn)換納米顆粒體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

程梓荷　李科

1研究背景

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和醫(yī)療水平的突飛猛進(jìn)，許多疾病的威脅已經(jīng)大大降低，然而惡性腫瘤仍為全世界嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的一大類(lèi)疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究中心（IARC）2020年發(fā)布的報(bào)告，2020年約996萬(wàn)人死于癌癥，其中中國(guó)癌癥死亡人數(shù)約300萬(wàn)，占癌癥死亡總?cè)藬?shù)30%，位居全球第一。據(jù)國(guó)家癌癥中心2019年1月發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015年我國(guó)總體惡性腫瘤發(fā)病率為285.83/10萬(wàn)例，其中死亡率為170.05/10萬(wàn)例。在過(guò)去的10余年，癌癥負(fù)擔(dān)呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)，惡性腫瘤發(fā)病率每年保持約3.9%的增幅，死亡率每年保持2.5%的增幅。目前臨床上惡性腫瘤的治療方式主要為放療、化療、手術(shù)治療三種，傳統(tǒng)的治療方法均存在不同程度的副作用，例如術(shù)后并發(fā)癥、正常細(xì)胞組織損害、免疫力低下等，可降低惡性腫瘤生存者的遠(yuǎn)期生活質(zhì)量和生存期。近年來(lái)，分子靶向治療、免疫治療等新型腫瘤治療方法的研究如火如荼，但尚未有突破性的革新。因此，急需開(kāi)發(fā)一種新型高效且精準(zhǔn)的惡性腫瘤治療方法。

上轉(zhuǎn)換納米顆粒（Upconversion Nanoparticles，UCNPs）主要由氧化物、氟化物和鹵氧化物等基質(zhì)通過(guò)摻雜三價(jià)稀土離子構(gòu)成，是一種低毒、穩(wěn)定和發(fā)光壽命長(zhǎng)的新型熒光探針，其避免了短波長(zhǎng)激發(fā)光（通常為紫外線）產(chǎn)生自體熒光后對(duì)發(fā)射光檢測(cè)的干擾，且因?yàn)椴ㄩL(zhǎng)較長(zhǎng)，對(duì)生物組織的穿透能力大大加強(qiáng)而對(duì)正常組織無(wú)侵害性，可實(shí)現(xiàn)深部組織非侵入式探測(cè)和治療。UCNPs還具有許多優(yōu)越的性能：優(yōu)異的光和物理化學(xué)穩(wěn)定性;生物相容性好;激發(fā)光譜窄，檢測(cè)靈敏度高;較高的成像信/噪比;光損傷效應(yīng)低;發(fā)射光穩(wěn)定性好、幾乎無(wú)光漂白現(xiàn)象：通過(guò)摻雜不同的稀土元素產(chǎn)生不同的發(fā)射光，實(shí)現(xiàn)多色同時(shí)檢測(cè)。這些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)使UCNPs在光、電、磁及生物醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域迅速成為研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，針對(duì)UCNPs在惡性腫瘤治療與診斷方面的主要研究方向?yàn)楣鈩?dòng)力治療、光熱療法、化學(xué)聯(lián)合療法、多模成像指導(dǎo)的診療一體化等。其中，因UCNPs和化學(xué)藥物的聯(lián)合應(yīng)用可有效提高藥物靶向性、增強(qiáng)化療效果，而具有更廣闊的應(yīng)用前景。

阿霉素及其生物活性衍生物作為臨床上常用的抗腫瘤藥物，可以直接導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷、活性氧的產(chǎn)生以及細(xì)胞凋亡，對(duì)乳腺癌、白血病等多種惡性腫瘤具有良好的治療效果。但也因此不可避免地帶來(lái)一系列抗癌不良反應(yīng)，如心臟毒性反應(yīng)、白細(xì)胞減少、血小板減少等，這不僅限制了其在腫瘤患者中的應(yīng)用，還降低了腫瘤患者的預(yù)后。為了解決這個(gè)問(wèn)題，人們將目光轉(zhuǎn)向DOX與UCNPs的聯(lián)合療法，因?yàn)閁CNPs不僅能實(shí)現(xiàn)光學(xué)成像，還可作為藥物遞送系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)定向給藥，提高DOX治療效果。

近些年來(lái)已有負(fù)載DOX的UCNPs對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)的研究報(bào)道，但尚未見(jiàn)體內(nèi)急性毒性研究的相關(guān)報(bào)道。本研究利用制備的NaYF₄：Yb³⁺，Er³⁺@NaGdF₄@mSiO₂-FA-DOXNPs，進(jìn)行BALB/c小鼠體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)及病理學(xué)變化分析，以評(píng)價(jià)其安全性，可為開(kāi)發(fā)惡性腫瘤治療新方法奠定理論基礎(chǔ)并提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2研究方法

2.1材料

2.1.1動(dòng)物

50只BALB/c小鼠，雌雄各半，體重（18±2）g，個(gè)體勻稱(chēng)、反應(yīng)靈活、皮毛濃密、眼睛光澤、鼻孔清潔、無(wú)分泌物、呼吸正常，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司。將小鼠維持在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下，室內(nèi)溫度21～25℃，相對(duì)濕度45%～55%，潔凈飲食，安靜通風(fēng)清潔環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，給予12h光照、12h黑暗循環(huán)。鼠籠為IVC鼠盒，鼠盒每次使用前應(yīng)滅菌消毒，墊料每周更換2次，飼料和飲水每周添加、更換3～4次。動(dòng)物飼養(yǎng)室保持清潔、干燥。所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.1.2藥品和主要試劑

D0x購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;NaYF₄：Yb³⁺，Er³⁺@NaGdF₄@mSiO₂-FA-DOX NPs由本實(shí)驗(yàn)室合成;蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

2.2方法

2.2.1分組及給藥

50只BALB/c小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只（雌雄各半），包括1個(gè)陰性對(duì)照組（生理鹽水），1個(gè)游離DOX組（尾靜脈注射給藥，5.0mg/kg）和3個(gè)UCD NPs組（尾靜脈注射給藥，5.0mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg，以DOX計(jì)），給藥后連續(xù)觀察14d。

2.2.2一般體征

每天觀察小鼠的一般體征、行為運(yùn)動(dòng)、精神狀態(tài)和死亡等情況并記錄小鼠質(zhì)量。

2.2.3主要臟器HE染色

14d后將小鼠安樂(lè)死，取出心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，將臟器用4%多聚甲醛固定。經(jīng)過(guò)修剪、脫水、透明、浸蠟、包埋后進(jìn)行石蠟組織切片，切片厚度為4～6μm。HE染色時(shí)，首先用二甲苯脫去切片中的石蠟，將已人蒸餾水后的切片放人蘇木素水溶液中染色數(shù)分鐘，蒸餾水沖洗后用含1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，0.6%氨水返藍(lán)15min后流水沖洗，入伊紅染液染色30s，染色后的切片經(jīng)脫水、透明后固定封片，用光學(xué)顯微鏡觀察。

3結(jié)果

3.1小鼠行為特征和體重變化

陰性對(duì)照組小鼠外觀體征、行為活動(dòng)、攝食量均正常。游離DOX組小鼠給藥后出現(xiàn)懶惰、嗜睡、活動(dòng)減少、厭食，立毛現(xiàn)象明顯，個(gè)別出現(xiàn)黏液便，體重下降相對(duì)較快，死亡率為80%。UCD NPs組小鼠精神狀態(tài)良好、活動(dòng)自如、攝食量、糞便未見(jiàn)明顯異常，體重有所下降，死亡率隨DOX劑量增加而增加，死亡率依次為30%、40%和60%。

3.2小鼠各臟器病理變化

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組小鼠各臟器組織細(xì)胞完整，核清晰可見(jiàn)，細(xì)胞質(zhì)豐富均勻，核膜清楚，無(wú)空泡化;游離DOX組小鼠心臟可見(jiàn)心肌細(xì)胞有不同程度的變性、壞死，心肌結(jié)構(gòu)紊亂，肌纖維部分?jǐn)嗔?，間隙擴(kuò)大，間質(zhì)內(nèi)有淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)，呈心肌炎表現(xiàn)：UCD NPs組小鼠僅表現(xiàn)為肝臟有輕微炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，這是因?yàn)閁CD NPs通過(guò)血液循環(huán)輸送到肝臟組織中，被肝臟組織中的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞吞噬，從而導(dǎo)致其在肝臟中蓄積，引起正常肝細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。隨著納米顆粒逐漸被肝臟代謝，肝細(xì)胞即可恢復(fù)正常。

4討論

惡性腫瘤是我國(guó)居民死亡的主要原因之一，雖然近年來(lái)其治療取得了一定的進(jìn)步，生存率有所提高，但常規(guī)療法仍存在一定局限性，療效尚不滿意。隨著納米技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，UCNPs的研究也愈發(fā)深入，其所具有的特殊的光學(xué)特性及良好的生物相容性等特點(diǎn)，為其構(gòu)建成為抗腫瘤藥物載體提供先決條件。UCNPs與化療藥物的聯(lián)合療法便是相關(guān)研究的熱點(diǎn)內(nèi)容之一。DOX作為一種臨床常用的化療藥物，可被負(fù)載于UCNPs，得到的納米顆?？梢越档虳OX的不良反應(yīng)、實(shí)現(xiàn)光學(xué)成像，具有廣闊的臨床研究前景。

現(xiàn)階段UCNPs的相關(guān)研究盡管在體外毒性方面已有一定的成果，但是在納米顆粒對(duì)動(dòng)物器官的影響、納米顆粒的體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)等方面仍需探索。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備的UCD NPs主要進(jìn)行BALB/c小鼠體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)及主要臟器病理學(xué)變化的研究。研究結(jié)果表明，游離DOX組小鼠給藥后大多數(shù)出現(xiàn)活動(dòng)異常，體重下降快，死亡率較高。HE染色可見(jiàn)明顯的毒性影響，表現(xiàn)為心肌纖維斷裂，細(xì)胞間隙變大，心肌細(xì)胞發(fā)生變性壞死或有炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)等改變。而UCD NPs組小鼠生命活動(dòng)基本正常，藥物毒性相對(duì)較小。UCD NPs組DOX劑量達(dá)到游離DOX組藥物劑量的兩倍時(shí)，死亡率仍低于游離DOX組;同等DOX濃度（5.0mg/kg）下，UCD NPs組的死亡率約為游離DOX組的1/3。由于納米顆粒在肝臟的暫時(shí)性蓄積，在光鏡下肝臟組織有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其他臟器結(jié)構(gòu)基本正常。

綜上所述.本研究通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UCD NPs可有效降低DOX的毒副作用，該研究結(jié)果可為日后的惡性腫瘤治療臨床新方法提供有效的參考。