基于生物信息學(xué)方法鑒定宮頸癌的生物標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白7

歐婷瑜，莫麗，何琦

（廣西壯族自治區(qū)南寧市第二人民醫(yī)院 婦科，廣西 南寧 530031）

0 引言

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，也是女性癌癥死亡的第四大原因。2020年全球統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，每年有近60.4萬宮頸癌新發(fā)病例，34.2萬例宮頸癌患者死亡[1]。其主要病理類型包括鱗狀細胞癌、腺癌、腺鱗癌等。盡管通過手術(shù)、放療等手段不斷提高了宮頸癌的早期治愈率，但仍有近30%的患者因復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移而死亡[2]。對于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的病例治療手段有限，且治療效果不理想。因此，尋找宮頸癌進展的生物標(biāo)志物及其確切分子機制有助于疾病的診斷和治療策略的選擇。

近年高通量測序和微陣列技術(shù)的出現(xiàn)推動了精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，不斷增加的大數(shù)據(jù)積累開辟了新的研究途徑。識別新的生物標(biāo)志物，使得宮頸癌的個性化治療策略成為一個重要話題，也是對復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移高危宮頸癌患者群體進行分層選擇靶向治療的先決條件。微管相關(guān)蛋白（microtubule associated protein，MAP）是一種細胞骨架與微管相互作用形成的蛋白質(zhì)，其微管相互結(jié)合并與微管表面相互作用有著穩(wěn)定微管的功能[3]，參與細胞分裂和分化等重要的細胞過程。MAP7在微管成束和動態(tài)調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。據(jù)報道，MAP7表達上調(diào)與結(jié)直腸癌、急性粒細胞性白血病、胃癌等多種癌癥預(yù)后相關(guān)[4]。本研究通過癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫鑒定MAP7在宮頸癌中的表達特征，并深入分析其生物學(xué)功能。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取與預(yù)處理。從TCGA官網(wǎng)下載宮頸鱗狀細胞癌和宮頸腺癌（CESC）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及臨床信息，通過R 4.0.4軟件將芯片信息轉(zhuǎn)換為基因名稱，與樣品名合成基因表達矩陣，并提取生存時間、生存狀態(tài)、疾病狀態(tài)、年齡、病理分級、組織學(xué)類型、臨床分期、TMN分期等相關(guān)臨床信息。

1.2 基因差異分析。利用R 4.0.4軟件“l(fā)imma”工具包提取MAP7基因的表達數(shù)據(jù)，采用wilcox檢驗對比分析正常組織與宮頸癌組織中的基因表達差異，P＜0.05提示有統(tǒng)計學(xué)意義。并利用人類蛋白質(zhì)圖譜（the Human Protein Atlas，HPA）網(wǎng)站比較正常組織與腫瘤組織的MAP7蛋白表達差異。

1.3 生存分析。根據(jù)MAP7基因表達情況以中位值為界限，分為高、低表達兩組，并通過R4.0.4軟件“survival”工具包對進行Kaplan-Meier分析，P＜0.05提示有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 臨床相關(guān)性分析。整合基因表達與樣品臨床信息，并將各臨床病理特征整理劃分為二分類變量，運用R 4.0.4軟件logit函數(shù)進行邏輯回歸分析，探索MAP7與各臨床特征的相關(guān)性，P＜0.05提示有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 獨立預(yù)后分析。采用單因素和多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析，檢測整個宮頸癌患者隊列中臨床病理特征及MAP7的基因表達是否是疾病預(yù)后的獨立變量，并通過R 4.0.4軟件“survival”工具包實現(xiàn)。P＜0.05提示有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 功能富集分析。對MAP7進行基因功能集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA），利用GSEA_4.1.0軟件及“c2.cp.kegg.v7.4.symbols”為背景，以P＜0.05并且FDR校正P＜0.05為條件篩選出顯著富集的通路。

2 結(jié)果

2.1 MAP7在宮頸癌組織中的表達情況。與正常組織（n=3）相比，MAP7在宮頸癌組織（n=306）中高表達（P=0.003，圖1A）。HPA數(shù)據(jù)庫的免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）分析結(jié)果顯示MAP7在宮頸癌組織中表達較高，在正常組織中表達較低（圖1B）。

圖1 MAP7在正常組織及宮頸癌組織中的表達情況

2.2 不同MAP7表達水平宮頸癌患者的生存分析。我們以MAP7表達中位值為截斷，將宮頸癌患者劃分為高、低表達兩個亞組，結(jié)合總生存時間（overall survival，OS）進行Kaplan-Meier分析，結(jié)果表明MAP7高表達組總生存率更低，MAP7低表達組具有更長的生存時間（P=0.011，圖2），說明MAP7的表達水平與宮頸癌預(yù)后相關(guān)。

圖2 MAP7高、低表達組宮頸癌患者的生存分析

2.3 MAP7與宮頸癌的臨床相關(guān)性。邏輯回歸分析結(jié)果顯示，MAP7的表達與疾病狀態(tài)（無病生存，復(fù)發(fā)或進展）密切相關(guān)（P＜0.05）。然而，MAP7在年齡、病理分級、組織學(xué)類型、臨床分期、TMN分期不同亞組中的表達比值比（odds ratio，OR）（P＞0.05，表1），說明MAP7的表達水平與疾病進展相關(guān)。

表1 MAP7與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4 MAP7在宮頸癌中的預(yù)后價值。在單因素Cox回歸分析中，臨床分期與MAP7與生存相關(guān)，MAP7的風(fēng)險比（hazard ratio，HR）及95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）為1.039（1.012～1.066，P＜0.05）。在多因素Cox回歸分析中，該基因的HR為1.041，95%CI 1.012～1.070（P＜0.05，表2）。結(jié)果說明MAP7可作為宮頸癌的獨立預(yù)后因子。

表2 MAP7與宮頸癌臨床病理特征的獨立預(yù)后分析結(jié)果

2.5 MAP7的相關(guān)分子機制。通過GSEA分析挖掘MAP7潛在的功能信號通路及生物學(xué)作用。結(jié)果顯示，在MAP7高表達組中，黏著連接、ERBB信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用、基底轉(zhuǎn)錄因子、磷酸肌醇代謝、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、TGF-β信號通路顯著富集。同時，MAP7的表達上調(diào)促進子宮內(nèi)膜癌、慢性粒細胞白血病、甲狀腺癌等多種癌癥的通路，同時抑制自身免疫性甲狀腺疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、同種異體移植物排斥、移植物抗宿主病、1型糖尿病、原發(fā)性免疫缺陷、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、哮喘、氧化磷酸化、核糖體等通路。

圖3 MAP7在宮頸癌中的KEGG功能富集結(jié)果

3 討論

近年來，手術(shù)和放療模式的不斷革新以及免疫治療的興起，晚期宮頸癌患者仍然存在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險。因此，需要探尋更多新的生物標(biāo)志物和治療靶點。MAP參與微管動力學(xué)，在細胞分裂、運動、分化和其他重要的細胞和細胞內(nèi)活動中不可或缺。微管的形成對有絲分裂至關(guān)重要，微管通過交替生長不斷地重塑和收縮他們的末端，這被稱為動態(tài)不穩(wěn)定性[7]。MAP7是一種非運動MAP，它與微管之間存在著獨特的相互作用，它最初是從HeLa細胞裂解物中鑒定出來的，主要在上皮細胞中表達。研究表明，MAP7通過直接與微管結(jié)合，促進微管的穩(wěn)定，在神經(jīng)元微管的形成中發(fā)揮了重要的作用[8]。在大鼠胚胎感覺神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)功能分析中發(fā)現(xiàn)，MAP7有兩個獨特的微管結(jié)合位點，具有解離動力和支鏈形成的雙重作用，并且動態(tài)招募蛋白激酶1到微管上，導(dǎo)致細胞器運輸行為的改變[9]。在果蠅實驗中發(fā)現(xiàn)MAP7有助于干細胞的自我更新[10]。然而，關(guān)于MAP7在癌癥中的作用研究仍較少。在細胞遺傳學(xué)正常的年輕急性髓系白血病患者中，MAP7表達上調(diào)，預(yù)示著較差的預(yù)后[5]。也有研究表明，MAP7介導(dǎo)加速胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲促進疾病的進展[6]。然而，MAP7在宮頸癌中預(yù)后預(yù)測的價值仍未有報道。我們通過TCGA數(shù)據(jù)庫CESC數(shù)據(jù)整合，鑒定了MAP7在宮頸癌中的表達特征，生存分析證實了基因高表達預(yù)示著不良結(jié)局，并運用臨床相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)MAP7與疾病的進展或復(fù)發(fā)有密切關(guān)系，并能夠作為獨立預(yù)后因素。在功能富集分析中，基因高表達顯著富集在慢性粒細胞白血病、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路，與上述既往研究結(jié)果一致。同時在ERBB信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用、TGF-β信號通路顯著富集，可以成為未來新的機制研究方向。我們還注意到，MAP7表達上調(diào)在促癌的同時，有抑制免疫系統(tǒng)疾病的可能。在研究中，我們通過新興的生物信息學(xué)技術(shù)鑒定了宮頸癌新的生物標(biāo)志物MAP7，但也存在一定的局限性。本研究的發(fā)現(xiàn)僅為大數(shù)據(jù)挖掘，仍有待進一步實驗驗證。

綜上所述，我們的研究表明，MAP7在宮頸癌中呈高表達，并且與不良預(yù)后有關(guān)，參與多種生物過程，是宮頸癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物，有望成為理想的治療靶點。