不同桑黃菌株生長特性及發(fā)酵液的抗氧化活性*

李學震，和法濤，馬艷蕊，劉光鵬，初 樂，鄭明珠

（1.中華供銷合作總社濟南果品研究院，山東 濟南 250220；2.吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林 長春130118）

桑黃菌（Sanghuangporus spp.）是一類黃褐色多年生稀有真菌，通常生長在桑樹上，屬真菌界（Fungi）擔菌子門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes） 銹革孔菌目（Hymenochaetales） 銹革孔菌科 （Hymenochaetaceae） 桑黃屬 （Sanghuangporus）[1]。粗毛纖空菌 [Inonotus hispidus(Bull.:Fr)P.Karst]，屬于銹革孔菌科 （Hymenochaetaceae） 纖孔菌屬（Ionnouts），有學者認為粗毛纖空菌是傳統(tǒng)中藥“桑黃”，與桑黃菌有相似功效[2]。在中國、韓國和日本等亞洲國家，桑黃常作為傳統(tǒng)中藥用于治療口腔潰瘍、胃腸疾病、淋巴疾病和癌癥等[3-4]。據(jù)報道，桑黃有抗炎癥、提高免疫和抑制腫瘤生長等作用[5-6]，其抗氧化能力也引起了大量學者的關注，桑黃能清除人體內(nèi)過量的自由基，并且這些自由基與炎癥、腫瘤和免疫下降的發(fā)生相偶聯(lián)[7]。如王一菲等[8]和閆景坤等[9]研究了不同桑黃抗氧化能力的相關指標，表明不同桑黃的抗氧化作用有顯著區(qū)別。

以往關于桑黃的研究大多集中在子實體活性物質的提取與活性評價，但野生桑黃受季節(jié)影響，生長緩慢，數(shù)量少不易獲得，而人工栽培比較困難[10]。因此，有研究人員利用液體發(fā)酵生產(chǎn)桑黃菌絲體，并從中提取活性成分，從而驗證了桑黃菌絲體黃酮比子實體黃酮有更強的抗氧化效果[11]。姜福春等[12]在發(fā)酵過程中添加乙酸鎂可促進菌絲體的產(chǎn)量和黃酮類物質的積累，且增強了體外抗氧化活性。

通過研究不同桑黃菌株生長特性，旨在對不同桑黃菌株的抗氧化能力進行比較，以期全面認識桑黃的生長特性和抗氧化特性，并為篩選適用于固體培養(yǎng)和液體發(fā)酵的桑黃提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

供試6個菌株，均由山東省臨清市哲碩農(nóng)產(chǎn)品有限公司提供，菌株情況詳見表1。

表1 菌種信息Tab.1 Information of strains

1.2 培養(yǎng)基及試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基，青島賓得生物技術有限公司；PDB培養(yǎng)基，北京索萊寶生物科技有限公司。

POD培養(yǎng)基，在PDA培養(yǎng)基中加入0.05%愈創(chuàng)木酚配置而成。

羧甲基纖維素培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5 g、七水硫酸鎂1 g、磷酸二氫鉀2 g、瓊脂15 g，蒸餾水1 L。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨3 g、酵母粉2 g、磷酸二氫鉀1.5 g、七水硫酸鎂0.75 g、氯化鈣0.75 g，蒸餾水1 L。

1.2.2 其他試劑

磷酸氫二鈉，天津科密歐化學試劑有限公司；磷酸二氫鈉、羧甲基纖維素鈉、三氯化鐵、愈創(chuàng)木酚，國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇，天津富宇精細化工有限公司；硫酸亞鐵、過氧化氫、鐵氰化鉀，天津大茂化學試劑廠；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH），梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，以上試劑均為分析純。

1.3 試驗儀器

BSC-150恒溫培養(yǎng)箱、YXQ-LS-100A型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；UV-1000型紫外分光光度儀，上海天美科學儀器有限公司；TDL-5A低速大容量離心機，上海安亭科學儀器；ME-104型萬分之一天平，梅特勒托利多儀器有限公司；HH-4型顯數(shù)恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；R308型旋轉蒸發(fā)儀，上海申生物科技有限公司，ZWYR-2112B型恒溫調速搖床柜，上海智誠分析儀器制造有限公司，F(xiàn)D-2型真空冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種平板活化與制備

取分離純化后的斜面菌株，在無菌操作臺上取0.5 cm2接入PDA平板，菌株長到4 cm～6 cm時，保存在4℃冰箱備用，使用前在28℃培養(yǎng)箱中恒溫6 h。

1.4.2 菌株生長速度測定

根據(jù)曲德輝等[13]的方法進行測定。

1.4.3 發(fā)酵菌絲生物量測定

發(fā)酵種子液制備：取平板上的菌絲，用直徑5 mm的打孔器打孔，使用250 mL的瓶子，裝液量為100 mL，每瓶接種 4塊。28℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，待菌絲長滿搖瓶，用手持攪拌器在無菌操作臺內(nèi)將菌絲打散，但不破壞細胞，放入4℃冰箱備用，使用前在搖床28℃恒溫6 h。

液體發(fā)酵培養(yǎng)：將制備好的6個菌株的液體種子液接入PDB培養(yǎng)基中，接種量為10%，使用500 mL的瓶子，裝液量為200 mL，每個菌種3瓶。28℃、20 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d。將培養(yǎng)發(fā)酵液5 000 r·min-1離心10 min，沉淀的菌絲體用蒸餾水清洗3次～5次，凍干稱重，上清液放入4℃冰箱保存以測定抗氧化活性。

1.4.4 相對酶活性測定

漆酶相對活性根據(jù)參考文獻[14]的方法進行測定。

羧甲基纖維素酶相對活性測定根據(jù)文獻[15]的方法進行測定。

1.4.5 發(fā)酵液抗氧化能力測定

1） 羥自由基清除能力測定

根據(jù)參考文獻[16]的方法并做一些改進，取8 mmol·L-1的FeSO4溶液和水楊酸溶液各1 mL混合，取制備好的發(fā)酵液各0.1 mL，加入混合液中震蕩搖勻。之后加入3%的H2O2溶液1 mL繼續(xù)震蕩搖勻使其充分反應，在水浴鍋中37℃保溫30 min，510 nm測定吸光值。羥自由基清除率（E1，%）計算公式為：

式中：A1為樣品反應體系的吸光度值；A2為去離子水代替H2O2反應體系的吸光度值；A0為去離子水代替樣品反應體系的吸光度值。

2）DPPH自由基清除能力測定

根據(jù)參考文獻[17]的方法進行測定，準確稱取DPPH試劑5 mg，溶于250 mL無水乙醇中，此時DPPH溶液濃度為0.02 mg·mL-1。取制備好的發(fā)酵液各0.1 mL加入3.9 mL的DPPH溶液中，常溫避光20 min，517 nm處測吸光度值。DPPH自由基清除率（E2，%） 計算公式為：

式中：A3樣品反應體系的吸光度值；A4為無水乙醇代替DPPH溶液反應的吸光度值；A0為無水乙醇代替樣品反應體系的吸光度值。

3）相對還原力測定

根據(jù)參考文獻[18]的方法進行測定，取0.5 mL發(fā)酵液加入0.6 mL的PBS緩沖液（0.2 mol·L-1、pH 6.6） 和質量分數(shù)1%的鐵氰化鉀1.5 mL?；靹蚝?0℃，保溫20 min，取出冷卻后，加入10%三氯乙酸2.5 mL。取混合液2.5 mL加2.5 mL蒸餾水和質量分數(shù)0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，靜置10 min后于700 nm處測吸光度值。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 22、Origin 9.0和 GraphPad Prism 8進行處理和圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 菌株生長特性

2.1.1 不同桑黃菌株平板培養(yǎng)生長狀態(tài)

6種桑黃菌株的生長特性見表2。

表2 不同桑黃菌株平板培養(yǎng)生長狀態(tài)Tab.2 The growth state of the flat plate culture of different Sanghuang strains

如表1所示，在相同培養(yǎng)條件下，不同桑黃菌株平板生長的菌絲密度有很大差異，其中東北桑黃D、楊樹桑黃Q和粗毛纖孔菌182的菌塊厚，菌絲密集；楊樹桑黃Q和粗毛纖孔菌124菌塊略薄，但菌絲密集；韓國桑黃H菌塊最薄，且菌絲稀疏，這可能與菌絲的生長速度有關。

2.1.2 不同桑黃菌株生長速度

6個桑黃菌株的生長曲線見圖1，生長速度見圖2。

圖1 不同桑黃菌株生長曲線Fig.1 Growth curve of different Sanghuang strains

圖2 不同桑黃菌生長速度Fig.2 Growth rates of different Sanghuang strains

如圖1、圖2所示，從生長曲線的斜率可以看出東北桑黃D和楊樹桑黃Q從接種后生長速度一直高于其他4個桑黃菌株。從第3天開始，東北桑黃D的生長速度有較明顯的上升，略微下降后，在第6天明顯上升，而楊樹桑黃Q生長速度一直保持平穩(wěn)。其他5個桑黃菌株在前3 d前生長速度相差較小，之后韓國桑黃H的生長速度保持平穩(wěn)，而粗毛纖孔菌182在第6天生長速度超過楊樹桑黃Q和粗毛纖孔菌124。11 d后東北桑黃D最先長滿平板，6個桑黃菌株的平均生長速度依次為東北桑黃D＞楊樹桑黃Q＞粗毛纖孔菌182＞粗毛纖孔菌124＞桑樹桑黃Y＞韓國桑黃H。

2.1.3 不同桑黃菌液發(fā)酵菌絲生物量

桑黃菌液發(fā)酵菌絲生物量統(tǒng)計見圖3。

圖3 不同桑黃菌株菌絲生物量Fig.3 Mycelium biomass of different Sanghuang strain

如圖3所示，在相同培養(yǎng)時間內(nèi)，粗毛纖孔菌182的菌絲生物量最高達（1.23 g）；而楊樹桑黃Q、桑樹桑黃Y和粗毛纖孔菌124的菌絲生物量相差不大，分別為1.11 g、1.13 g和1.07 g；產(chǎn)量最低的是韓國桑黃H，菌絲生物量僅有0.73 g。值得注意的是東北桑黃D菌絲生物量只超過了韓國桑黃H，與其平板培養(yǎng)的生長速度不一致，這表明東北桑黃D適用于固態(tài)發(fā)酵，而粗毛纖孔菌182適用于液體發(fā)酵。

2.2 不同桑黃菌株相對酶活性

漆酶和羧甲基纖維素酶能分解木質素和纖維素為桑黃菌絲生長提供養(yǎng)料，同時參與氧化呼吸過程中的電子鏈傳遞，為桑黃生長提供更多能量并促使菌絲體內(nèi)物質合成和積累[19]。以變色圈大小表示漆酶和羧甲基纖維素酶活性的高低，即變色圈越大酶活性越高，6個菌株漆酶和羧甲基纖維素酶活性試驗結果見表3。

如表3所示，6個菌株的2種酶活性差異較大，羧甲基纖維素酶活性最強的是東北桑黃D，其次是楊樹桑黃Q和桑樹桑黃Y，而粗毛纖孔菌124未檢出羧甲基纖維素酶；漆酶活性最高的是韓國桑黃H，但6個菌株漆酶活性差異并不顯著。

表3 不同桑黃菌株相對酶活性Tab.3 Relative enzyme activity of different Sanghuang strains

2.3 發(fā)酵液抗氧化能力

2.3.1 羥自由基清除率測定

6種桑黃羥自由基清除率見圖4。

圖4 不同桑黃菌株羥自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging rates of different Sanghuang strains

如圖4所示，楊樹桑黃Q和東北桑黃D發(fā)酵液的羥自由基清除率最高，分別達到85.39%和72.28%，其次是韓國桑黃H和桑樹桑黃Y，分別達到70.96%和62.68%，清除率最低的是粗毛纖空菌182和124，分別為53.18%和51.75%。

2.3.2 DPPH自由基清除率測定

DPPH是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，在517 nm處有最大吸收波長，當加入抗氧化物質時，自由基被清除，其在517 nm處的最大吸收會減少[20]。因此可以通過檢測517 nm處的吸光度值來判斷活性物質的DPPH自由基清除活性。6個桑黃菌株發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力結果見圖5。

圖5 不同桑黃菌株DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH radical scavenging rate of different Sanghuang strains

如圖5所示，東北桑黃D和粗毛纖孔菌182的清除率最高，分別為91.93和86.73%。其余4個桑黃菌株的DPPH自由基清除率均不超過80%，最低的是楊樹桑黃Q，清除率僅為57.58%。

2.3.3 相對總還原力測定

還原性物質能使鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，與反應體系中的三氯化鐵進一步反應生成普魯士藍Fe4[Fe(CN)6]3，在700 nm處有最大吸收值，且吸光度值越大表明還原能力越強[21]。6個桑黃菌株發(fā)酵液中還原力結果見圖6。

圖6 不同桑黃菌株相對總還原力Fig.6 Relative total reduction force of different Sanghuang strains

如圖6所示，相對總還原力最高的是東北桑黃D，其次是粗毛纖孔菌182，結果與DPPH清除能力結果相似，其余4個桑黃菌株發(fā)酵液相對還原力大小為桑樹桑黃Y＞粗毛纖孔菌124＞韓國桑黃H＞楊樹桑黃Q。

3 結論

以6個不同桑黃菌株為研究對象，利用固體培養(yǎng)和液體發(fā)酵觀察桑黃的生長狀態(tài)，考查桑黃菌的生長速度及菌絲生物量，比較不同桑黃菌株漆酶和羧甲基纖維素酶的相對活性，通過測定羥自由基清除率、DPPH自由基清除率和總還原力評價桑黃抗氧化能力。結果表明，菌絲密度與桑黃生長速度呈正相關；菌絲生物量結果表明，東北桑黃D適用于固體培養(yǎng)而粗毛纖孔菌182適用于液體發(fā)酵；羥自由基清除率、DPPH自由基清除率和總還原力測定表明，東北桑黃D和粗毛纖孔菌182均有較強抗氧化能力。試驗結論為桑黃類真菌的發(fā)酵培養(yǎng)提供了新的評價依據(jù)，也為桑黃類真菌抗氧化活性物質的進一步深入研究奠定基礎。