不同菌株靈芝發(fā)酵液抗氧化和美白活性差異比較分析*

張周美，謝純良，顏少慰，周映君，朱作華，龔文兵，嚴(yán) 理，胡鎮(zhèn)修，彭源德**

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410205；2.湖南御家化妝品有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

靈芝（Ganoderma lucidum Karst）為層菌綱（Hymenomycetes） 多孔菌目（Polyporales） 多孔菌科（Polyporaceae） 靈芝屬（Ganoderma） 真菌，又名還陽(yáng)草、瑞芝等，含有多糖、氨基酸和靈芝酸等多種生物活性物質(zhì)，《本草綱目》中記載其具有清除自由基、抗炎、抗過(guò)敏、保濕、延緩皮膚衰老、祛斑、美白、改善角質(zhì)層等功效[1-2]。因此，靈芝提取物廣泛應(yīng)用于各類(lèi)化妝品中。

目前在化妝品市場(chǎng)上應(yīng)用的主要原料是靈芝子實(shí)體水提物和醇提物，如靈芝三萜等[3]。然而野生靈芝物種逐漸減少，人工培養(yǎng)子實(shí)體周期長(zhǎng)，且占地面積大，易受季節(jié)和原料等諸多因素影響。因此，來(lái)源于子實(shí)體的靈芝化妝品原料成本普遍較高[4-5]，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，需要探索一種低成本生產(chǎn)靈芝化妝品原料的方法[6-7]。

目前，在抗生素的生產(chǎn)上已經(jīng)廣泛使用真菌液體深層發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)。液體深層發(fā)酵培養(yǎng)具有許多優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)量大，發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基組成和時(shí)間等發(fā)酵條件更容易控制，成本較低[8-9]。將靈芝的菌絲體接種于液體培養(yǎng)基中，以一定轉(zhuǎn)速和溫度進(jìn)行培養(yǎng)，菌絲體在培養(yǎng)基中獲得合成代謝產(chǎn)物或生長(zhǎng)繁殖所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)方式稱(chēng)為靈芝液體深層發(fā)酵培養(yǎng)。目前，該發(fā)酵技術(shù)主要運(yùn)用于生產(chǎn)靈芝菌絲體多糖和三萜，有研究表明，液體深層發(fā)酵產(chǎn)生的靈芝多糖與子實(shí)體多糖具有大致相同的功能[10-11]。但是，基于液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的靈芝發(fā)酵液是否能成為化妝品原料的相關(guān)研究較少。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)我國(guó)靈芝有103種，占世界靈芝種類(lèi)的88%，其中具有護(hù)膚價(jià)值的僅有10種[12]。由于不同菌株遺傳背景不同，其護(hù)膚活性也有顯著差異[13]。已有研究表明，不同靈芝菌株通過(guò)液體深層發(fā)酵后發(fā)酵液中的多糖和三萜含量具有顯著差異，但是對(duì)不同菌株的發(fā)酵液抗氧化和美白活性比較分析相關(guān)研究較少[14]。黑色素生物合成中最重要的酶是酪氨酸酶，因此檢測(cè)酪氨酸酶活性的抑制率即可體現(xiàn)發(fā)酵液的美白活性[15]。

本研究利用液體深層發(fā)酵技術(shù)對(duì)靈芝進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)不同來(lái)源靈芝菌株發(fā)酵液中DPPH自由基清除率、超氧陰離子清除率、酪氨酸酶活性以及多糖、三萜含量進(jìn)行測(cè)定，以期篩選出抗氧化和美白活性更好的靈芝菌株。降低靈芝類(lèi)化妝品原料成本，以期擴(kuò)大靈芝發(fā)酵液在護(hù)膚品行業(yè)的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

齊墩果酸、Tris，賽國(guó)生物科技有限責(zé)任公司；磷酸二氫鈉、苯酚，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；香蘭素、無(wú)水乙醇，湖南匯虹試劑有限公司；焦性沒(méi)食子酸、冰醋酸、磷酸氫二鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；七水合硫酸亞鐵，廣東省臺(tái)山市化工廠；Polypheno10 Oxidase，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；DPPH，梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；胰蛋白胨、酵母膏，賽默飛世爾科技公司；麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基（MEA培養(yǎng)基），青島日水生物技術(shù)有限公司；發(fā)酵專(zhuān)用豆粕粉，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物菌株

本試驗(yàn)中使用的4個(gè)靈芝菌株分別來(lái)自中國(guó)普通微生物菌株保藏中心（菌株編號(hào)CGMCC 5.1817）、中國(guó)工業(yè)微生物菌株保藏管理中心（菌株編號(hào)CICC 14022）和中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌株保藏管理中心（菌株編號(hào)ACCC 51718和ACCC 51726）。各菌株在恒溫培養(yǎng)箱28℃條件下分別于MEA瓊脂培養(yǎng)基（麥芽提取物1.2%、瓊脂2%、葡萄糖1%）中培養(yǎng)7 d。

1.2.2 靈芝液體深層發(fā)酵條件的優(yōu)化

將4片不同菌株來(lái)源的靈芝菌絲體（每片約40 mm2），接種到麥芽浸粉培養(yǎng)基中（MEA培養(yǎng)基，配方為麥芽提取物20 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、酵母提取物 1 g·L-1、大豆蛋白胨 2.5 g·L-1、蛋白胨 1 g·L-1，pH 5.5） 或完全培養(yǎng)基（CYM培養(yǎng)基，配方為葡萄糖 20 g·L-1、酵母提取物 2 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、蛋白胨2 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、K2HPO40.46 g·L-1）中。30℃、180 r·min-1培養(yǎng)3 d～7 d。培養(yǎng)完成后，離心25 min（5 000 r·min-1），收集上清液，通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾后保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 不同靈芝菌株發(fā)酵液的抗氧化活性檢測(cè)

取1 mL樣品，加入1 mL的DPPH溶液（0.2 mmol·L-1），混合后室溫靜置30 min，于517 nm測(cè)其吸光度，每個(gè)樣品測(cè)3次平行。DPPH自由基清除率（Q，%） 計(jì)算公式為[16]：

式中：As為1 mL的DPPH乙醇溶液加1 mL樣品的吸光度；Ax為1 mL溶劑加1 mL樣品的吸光度；A0為1 mL的DPPH乙醇溶液加1 mL溶劑的吸光度。

在10 mL試管中加入5.7 mL的Tris-HCl緩沖液（50 mmol·L-1，pH 8.2）[17]，加入 0.2 mL 樣品混合后放置于25℃水浴鍋中，10 min后取出，再加0.1 mL（10 mmol·L-1）鄰苯三酚溶液（已預(yù)熱）[18]。超氧陰根離子自由基清除率（W，%）計(jì)算公式為：

式中：Aj為0.2 mL樣品加5.7 mL的Tris-HCl緩沖液與0.1 mL鄰苯三酚溶液快速混勻后1 min內(nèi)吸光度的增加值；Ai為0.2 mL純水加5.7 mL的Tris-HCl緩沖液與0.1 mL鄰苯三酚溶液快速混勻后1 min內(nèi)吸光度的增加值。

1.2.4 不同靈芝菌株發(fā)酵液酪氨酸酶活性抑制檢測(cè)

使用酪氨酸酶活性抑制試驗(yàn)方法，以L-酪氨酸作為底物進(jìn)行測(cè)定[19]。試驗(yàn)體系組成見(jiàn)表1。

表1 酪氨酸酶活性抑制率試驗(yàn)體系Tab.1 Experimental system of inhibition rate of tyrosinase activity

將PBS、酪氨酸酶、樣液按表1體積分別添加至4組試管中，混勻，37℃水浴鍋中恒溫加熱10 min，后加入1 mL的L-酪氨酸，繼續(xù)在37℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)10 min，最后在冰水中迅速冷卻，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定475 nm處4組試管吸光度[20]。酪氨酸酶活性抑制率（K，%）以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：A1為3 mL的PBS加1 mL的L-酪氨酸在475 nm處吸光度；A2為1 mL酪氨酸酶加2 mL的PBS、1 mL的L-酪氨酸在475 nm處吸光度；A3為2 mL的PBS加1 mL樣品、1 mL的L-酪氨酸在475 nm處吸光度；A4為1 mL酪氨酸酶加1 mL的PBS、1 mL樣品、1 mL的L-酪氨酸在475 nm處吸光度。

1.2.5 不同靈芝菌株發(fā)酵液多糖含量檢測(cè)

采用苯酚-硫酸法，測(cè)定抗氧化及美白活性較優(yōu)培養(yǎng)基的靈芝液體深層發(fā)酵液中多糖含量[21]。分別吸取一定梯度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液置于試管中，用超純水定容至1.0 mL，得到9個(gè)不同濃度的葡萄糖溶液 （0、0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、 0.05 mg·mL-1、 0.06 mg·mL-1、 0.07 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1），向試管中加入1.0 mL苯酚溶液（0.5%）后，立即加入5.0 mL濃硫酸，快速混勻靜放置反應(yīng)30 min，490 nm下測(cè)吸光度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

取1 mL樣品液，用3倍體積95%乙醇進(jìn)行醇析24 h，后5 500 r·min-1離心30 min，去除上清液，收集沉淀放超低溫冷凍干燥機(jī)中干燥2 h～3 h[22]，后加入超純水20 mL，溶解其中沉淀物并稀釋到一定的濃度，直至完全溶解，再吸取其中1 mL待測(cè)樣品液，使用苯酚-硫酸法測(cè)定其吸光度，再按照葡萄糖標(biāo)曲線計(jì)算待測(cè)樣品液的總糖含量。

1.2.6 不同靈芝菌株發(fā)酵液三萜含量檢測(cè)

精確移取 100 μg·mL-1齊墩果酸溶液 0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL 置于試管中[21]。將所有試管進(jìn)行水浴加熱直至溶劑揮發(fā)干，然后加入1 mL高氯酸和0.4 mL的5%香草醛-冰醋酸溶液，快速混勻，后于65℃水浴鍋中恒溫加熱15 min，常溫冷卻后，用冰醋酸將溶液體積調(diào)節(jié)至5 mL，在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)量其吸光度。將標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度和濃度分別設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)曲線的垂直和水平坐標(biāo)，依據(jù)兩者的關(guān)系，建立回歸方程，重復(fù)上述方法測(cè)定靈芝中三萜的含量。

參照參考文獻(xiàn)[23]，使用香草醛-高氯酸顯色法，在試管中加入0.1 mL抗氧化及美白活性較優(yōu)培養(yǎng)基的靈芝發(fā)酵液，加入0.9 mL無(wú)水乙醇，在室溫條件下靜置1 h后，沸水浴使液體揮發(fā)，直至干燥，以干凈試管為空白對(duì)照組，在樣液及空白試管中加入0.4 mL的5%香草醛-冰醋酸溶液以及1 mL的高氯酸迅速混合均勻，進(jìn)行65℃、15 min的水浴加熱，測(cè)定其在550 nm波長(zhǎng)處的吸光度，取3組平行樣吸光度的平均值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出樣品的三萜含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同靈芝菌株發(fā)酵液抗氧化能力

不同菌株在不同培養(yǎng)條件下發(fā)酵液的DPPH自由基清除率統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖1。

圖1 4個(gè)靈芝菌株液體深層發(fā)酵液中DPPH自由基的清除率結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.1 Statistics of the scavenging rates of DPPH of the submerged fermentation broth of four Ganoderma lucidum strains

由圖1結(jié)果表明，麥芽浸粉培養(yǎng)基（MEA培養(yǎng)基）中4個(gè)靈芝菌株發(fā)酵液的DPPH清除率均顯著高于CYM培養(yǎng)基。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，4個(gè)靈芝發(fā)酵液的DPPH清除率均顯著增加，在5 d～6 d達(dá)到最大值。麥芽浸粉培養(yǎng)基培養(yǎng)比較6 d時(shí)比較4個(gè)靈芝菌株發(fā)酵液的DPPH自由基清除率發(fā)現(xiàn)，菌株CGMCC 5.1817發(fā)酵液的DPPH自由基清除率最高，達(dá)到94.08%，菌株ACCC 51718發(fā)酵液的DPPH自由基清除率最低，為88.64%。4個(gè)靈芝菌株液體深層發(fā)酵液對(duì)超氧陰離子清除率見(jiàn)圖2。

圖2 4個(gè)靈芝菌株液體深層發(fā)酵液中超氧陰離子的清除率結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.2 Statistics of the scavenging rates of superoxide anions of the submerged fermentation broth of four Ganoderma lucidum strains

由圖2可知，在麥芽浸粉培養(yǎng)基中4個(gè)靈芝菌株發(fā)酵液對(duì)超氧陰離子清除率大部分優(yōu)于CYM培養(yǎng)基。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，4個(gè)靈芝發(fā)酵液的超氧陰離子清除率也均顯著增加，在5 d時(shí)達(dá)到最高，6 d后逐漸下降。在培養(yǎng)5 d時(shí)，在麥芽浸粉培養(yǎng)基中菌株CICC 14022液體深層發(fā)酵液的超氧陰離子清除率達(dá)25%，高于清除率最低的菌株ACCC 51718液體深層發(fā)酵液近3倍，菌株ACCC 51718發(fā)酵液的清除率最低，僅為9%；此時(shí)，菌株CGMCC 5.1817發(fā)酵液的超氧陰離子清除率為13.6%。

2.2 不同靈芝菌株發(fā)酵液美白能力

不同菌株在不同培養(yǎng)條件下的靈芝發(fā)酵液美白能力檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 4個(gè)靈芝液體深層發(fā)酵液對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.3 Statistics of the inhibition rates of tyrosinase activity of the submerged fermentation broth of four Ganoderma lucidum strains

圖3結(jié)果表明，麥芽浸粉培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下4個(gè)靈芝菌株發(fā)酵液對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率均高于CYM培養(yǎng)基。同時(shí)，不同發(fā)酵時(shí)間靈芝發(fā)酵液對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率也有顯著差異，發(fā)酵前6 d，其抑制率逐漸升高，在發(fā)酵第6天時(shí)，麥芽浸粉培養(yǎng)基中液體深層發(fā)酵菌株CGMCC 5.1817發(fā)酵液對(duì)酪氨酸酶活性抑制率最高，達(dá)90.26%。菌株CICC 14022發(fā)酵液的抑制率最低，為87.4%，二者差異不顯著。

2.3 麥芽浸粉培養(yǎng)基培養(yǎng)的靈芝發(fā)酵液多糖含量及三萜含量

由于試驗(yàn)中麥芽浸粉培養(yǎng)基培養(yǎng)的靈芝抗氧化活性及美白能力較高。因此，對(duì)靈芝麥芽浸粉發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)，其多糖及三萜含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4～圖5。

圖4 4個(gè)靈芝菌株液體深層發(fā)酵液中的多糖含量結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.4 Statistics of the polysaccharide content of the submerged fermentation broth of four Ganoderma lucidum strains

圖5 4個(gè)靈芝菌株液體深層發(fā)酵液中三萜的含量結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.5 Statistics of the triterpene content of the submerged fermentation broth of four Ganoderma lucidum strains

由圖4可知，菌絲體多糖含量從第5天開(kāi)始出現(xiàn)明顯增加趨勢(shì)，至第6天時(shí)靈芝菌株發(fā)酵液中多糖含量最高。4個(gè)靈芝菌株中，菌株CGMCC 5.1817和菌株CICC 14022發(fā)酵液中的多糖含量最高，均達(dá)3.4 mg·mL-1，菌株ACCC 51726發(fā)酵液中多糖含量最低，為2.6 mg·mL-1。在7 d時(shí)靈芝發(fā)酵液中多糖含量開(kāi)始下降。

由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)（3 d～5 d），三萜含量顯著增加，在第6天時(shí)達(dá)到最大值，第7天開(kāi)始下降。在第6天時(shí)，靈芝菌株CGMCC 5.1817與菌株CICC 14022發(fā)酵液中三萜含量差異顯著，菌株CGMCC 5.1817發(fā)酵液的三萜含量最高，達(dá)1 550 μg·mL-1，是菌株CICC 14022的3倍，其三萜含量最低，為 480 μg·mL-1。

3 討論

靈芝富含多種生物活性物質(zhì)，主要是三萜類(lèi)化合物、多糖、類(lèi)固醇、核苷酸、脂肪酸、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖肽等[24]。由于靈芝的結(jié)構(gòu)具有多樣性，其功能也不同，包括抗氧化作用、抗皰疹病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗癌等特性，只有特定品種的靈芝才有良好的抗氧化活性和美白活性[24]。市場(chǎng)上靈芝產(chǎn)品繁多，多利用的是靈芝子實(shí)體提取物，子實(shí)體價(jià)格高，使得靈芝類(lèi)化妝品的原料成本過(guò)高。培養(yǎng)靈芝的傳統(tǒng)方法需要數(shù)月或1年，液體深層發(fā)酵液因不需要進(jìn)一步提取，可以減少生產(chǎn)含有功能活性成分原料的時(shí)間和成本。通過(guò)探究利用液體深層發(fā)酵技術(shù)替代子實(shí)體提取來(lái)制備低成本靈芝化妝品原料的可行性，以期篩選抗氧化和美白活性較好的菌株。結(jié)果表明，采用麥芽浸粉培養(yǎng)基4個(gè)靈芝菌株發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基清除率、超氧陰離子清除率、酪氨酸酶活性的抑制率均高于CYM培養(yǎng)基。靈芝在進(jìn)行液體深層發(fā)酵時(shí)培養(yǎng)基中的碳源、氮源等對(duì)其子實(shí)體的DPPH自由基清除率、超氧陰離子清除率、酪氨酸酶活性的抑制率均有影響。靈芝以可溶性淀粉為可利用碳源，其足夠靈芝子實(shí)體后期生長(zhǎng)需要且容易被吸收利用[25]。蛋白胨中含有糖類(lèi)、維生素、氮源，是真菌培養(yǎng)基的主要原料。蛋白胨的添加量與子實(shí)體的生長(zhǎng)在一定程度上呈正相關(guān)[24]。麥芽浸粉培養(yǎng)基中碳源可溶性淀粉含量、氮源中蛋白胨含量均高于CYM培養(yǎng)基。DPPH自由基、超氧陰離子的清除力測(cè)定結(jié)果表明，菌株CICC 14022的液體深層發(fā)酵液中超氧陰離子清除率比菌株CGMCC 5.1817高出10%，但其DPPH自由基清除率低于菌株CGMCC 5.1817，綜上，菌株CGMCC 5.1817與菌株CICC 14022相比抗氧化活性無(wú)顯著差異。

由于酪氨酸酶在黑色素合成過(guò)程中是必不可少的，其抑制劑在化妝品行業(yè)中的作用越來(lái)越重要[14]。酪氨酸酶抑制劑可作為一種強(qiáng)效美白劑，可改善皮膚問(wèn)題[26]。由于靈芝是具有生物活性的化學(xué)物質(zhì)的豐富來(lái)源，且大多數(shù)靈芝無(wú)較大的副作用，人們對(duì)從天然來(lái)源的酪氨酸酶抑制劑的興趣日漸增加，靈芝的乙醇提取物已顯示出抑制酪氨酸酶活性的作用[27]。然而，目前尚無(wú)靈芝液體深層發(fā)酵液抑制酪氨酸酶活性的研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯著表明，在4個(gè)菌株中，菌株CGMCC 5.1817液體深層發(fā)酵液具有良好的美白活性，其酪氨酸酶抑制率高達(dá)90.26%。

目前的研究中，多糖和三萜是靈芝最常見(jiàn)的天然化合物，與靈芝的抗氧化活性有關(guān)。研究結(jié)果表明，不同菌株和不同發(fā)酵時(shí)間的靈芝液體深層發(fā)酵液，其多糖和三萜含量有區(qū)別。在發(fā)酵前期，靈芝菌絲體正處于生長(zhǎng)階段，需要消耗發(fā)酵液中較多的營(yíng)養(yǎng)成分，使發(fā)酵液中多糖和三萜含量增加不明顯[28]；在發(fā)酵中期靈芝生長(zhǎng)旺盛，其自身所含的多糖和三萜含量顯著增加；在發(fā)酵后期，靈芝中的多糖和三萜已全部釋放，但隨著靈芝子實(shí)體生長(zhǎng)需繼續(xù)消耗多糖和三萜，所以其多糖和三萜含量會(huì)逐漸降低[29]。菌株ACCC 51718和菌株ACCC 51726發(fā)酵液中三萜含量未有顯著差異，菌株CICC 14022液體深層發(fā)酵液中多糖含量為3.4 mg·mL-1，與菌株CGMCC 5.1817多糖含量近似，但其三萜含量相差3倍（480 μg·mL-1）。因此，菌株CGMCC 5.1817發(fā)酵液中多糖、三萜的含量最高。

綜上所述，研究結(jié)果清楚地表明了靈芝的培養(yǎng)條件和菌株來(lái)源對(duì)抗氧化活性和美白活性均有影響。4個(gè)菌株中，菌株CGMCC 5.1817具有很強(qiáng)的清除自由基能力以及酪氨酸酶抑制活性，且多糖和三萜含量較高。因此其在抗衰及美白類(lèi)化妝品市場(chǎng)有很大的發(fā)展空間。