混合接種不同叢枝菌根真菌對云木香根際微生物及土壤酶活性的影響

魏祖晨，趙順鑫，李卓蔚，趙晶晶，周 濃，郭冬琴

（重慶三峽學院生物與食品工程學院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶404120）

木香（Saussurea costus）作為菊科風毛菊屬植物主要以云木香和川木香兩種形式為主［1］，以其根入藥，具有利脾化食和行氣止痛之效，可治療積食、嘔吐瀉痢、胸腹脹痛以及消化不良等病癥，故作為治療胃腸道常用藥［2］。市場上的木香藥材多年以來主要依賴于野生采挖，導致野生資源幾近枯竭，因此尋找合適的木香人工育苗方法顯得尤為重要。

叢枝菌根真菌（AMF）是土壤中的一類有益菌，可與80%以上的植物根系共生［3］。侵染率是表示其與宿主植物是否能建立共生關系的重要指標，侵染率越高表明AMF 與植物形成的共生關系越緊密。侵染主要是通過形成叢枝結構實現(xiàn)，AMF 的一端深入植物根系細胞內(nèi)與宿主植物進行物質(zhì)交換，另一端則穿越根際，擴大根際對土壤中營養(yǎng)成分的吸收［3-4］。此外，AMF 與植物形成的菌根還會使植物根際的微生物群落比例和土壤酶活性都會發(fā)生變化［5］。綠化植物接種AMF 后，其根際微環(huán)境中的土壤養(yǎng)分含量、土壤微生物數(shù)量以及土壤酶活性都顯著增加，土壤肥力明顯提高［6］。連作土壤施用AMF 能夠明顯提高土壤酶活性以及解決土壤微生物群落比例不均等問題［7］。因此，采用不同AMF 混合接種以改善和增強土壤環(huán)境已成為一種趨勢。

土壤酶活性既可以反映土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況，還可以增加土壤碳、氮、磷含量，提高土壤肥力［8］。此外，土壤酶活性還與土壤中微生物間的關系極其密切。在生理代謝過程中，土壤酶活性增強可以加速有機物含量的增加，為微生物大量生長提供所需的養(yǎng)分，促使微生物的繁殖速度加快，使微生物的生長環(huán)境得到改善；而微生物也可以向土壤中不斷分泌各種酶，使土壤中酶活性也大大地提升［9］。因此，適宜的土壤酶活性與健康的微生物環(huán)境能使植物健康生長。本課題組前期研究表明，接種AMF 能提高云木香葉片中營養(yǎng)成分含量和抗氧化酶的活性，增強云木香的抗逆能力［10］。木香苗期接種不同AMF 對其根際土壤養(yǎng)分、微生物數(shù)量以及土壤酶活性均有一定影響，外源接種AMF 有利于木香幼苗的生長［11］。結合課題組前期成果及相關文獻［6-11］，本研究混合接種不同AMF 對云木香根際微生物以及土壤酶活性的影響，為AMF 在云木香生產(chǎn)實踐中的應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

云木香種子主要采集于重慶市開縣大進鎮(zhèn)云木香種植基地，該基地海拔高度為325 m，屬于暖濕亞熱帶季風氣候。挑選株高1.6~1.8 m、莖葉完好的云木香健壯植株，采集成熟、新鮮的種子2 000 粒左右，經(jīng)重慶三峽學院周游博士鑒定為菊科植物-云木香（S.costus）。

1.2 樣品處理

AMF 純凈菌劑購買自美利堅共和國國際叢枝菌根真菌種質(zhì)資源保藏中心（INVAM），經(jīng)重慶三峽學院微生物實驗室進行擴增繁殖以及儲存保管［12］，菌劑擴繁使用河沙與山基土（1：3）混合制成培養(yǎng)基質(zhì)。試驗組構建菌種組合的試驗方案見表1［13］。

表1 不同處理組及其接種AMFTable 1 Different treatment groups and inoculated AMF

于重慶市萬州區(qū)鐵峰山國家森林公園室內(nèi)進行盆栽試驗，栽培用容器為15 cm×18 cm 的棕色塑料花盆（用酒精擦拭3 遍后用），栽培介質(zhì)與菌劑擴繁基質(zhì)相同，在121℃滅菌2 h。

試驗主要包括7 個處理組，其中，6 組混合接種AMF 作為處理組（育苗時接種AMF）和1 組對照（CK組），每處理組各10 次重復。每盆播種20 粒云木香種子，播種前種子用10%次氯酸鈉溶液消毒15 min后，清水沖洗干凈，晾干備用。播種時將AMF菌土均勻施于云木香種子的表土下，每盆按照10 mL劑量進行接種，孢子密度約為30個/mL，主要由帶有孢子、菌絲及侵染后根段的栽培基質(zhì)混合制成。同時播種紫云英混合培養(yǎng)，紫云英種子也需要用10%次氯酸鈉溶液消毒15 min，清水沖洗干凈，晾干備用。待云木香幼苗出土后除去紫云英植株，出苗后間苗3株，幼苗生長過程中不接種AMF。CK組不接種AMF，其他處理方式與處理組一致。將盆栽放置于室溫（自然光照）下，定期觀察與分析，按照云木香的常規(guī)養(yǎng)護方法管理，每周澆1次Hoagland營養(yǎng)液。

1.3 指標測定方法

1.3.1 孢子密度測定

孢子密度采用濕篩傾注蔗糖離心法測定孢子數(shù)量，以每10 g 土樣所含孢子的數(shù)量表示孢子密度［14］。

1.3.2 叢枝菌根真菌侵染率和侵染強度測定

將云木香樣品根系剪成1 cm 根段，從中隨機選取30 條大小均勻一致的根系進行侵染率和侵染強度的測定。將選取好的根系置于10%氫氧化鉀溶液中，90℃恒溫水浴加熱45 min后，棄去氫氧化鉀溶液，將根系水洗凈，再用1%鹽酸溶液進行酸化，經(jīng)前處理的根系放入90℃乳酸甘油曲利本藍染液中加熱45 min，最后將處理好的根系用十字交叉法測定AMF 的侵染率。根據(jù)黃艷萍等［15］的方法統(tǒng)計菌根侵染率和侵染強度。

1.3.3 土壤養(yǎng)分測定

速效氮、速效磷、有機質(zhì)和有機碳含量分別采用堿解擴散法、碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法、K2Cr2O7和濃H2SO4加熱法和重鉻酸鉀外加熱法進行測定［16］，pH值采用酸度計進行測定。

1.3.4 土壤微生物數(shù)量測定

采用牛肉膏培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基和高氏一號培養(yǎng)基分別對細菌、真菌和放線菌進行培養(yǎng)及計數(shù)［17］，按照公式計算土壤內(nèi)微生物群落總量：

微生物群落總量（103）=細菌+真菌+放線菌

1.3.5 土壤酶活性測定

過氧化氫酶、土壤蛋白酶、磷酸酶、蔗糖酶以及脲酶活性分別采用紫外分光光度法、改良茚三酮比色法、對硝基苯磷酸二鈉法、3，5-二硝基水楊酸比色法以及靛酚比色法進行測定［18］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003軟件和SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 混合接種不同AMF 對云木香根際土中孢子密度的影響

由圖 1 可知，與 CK 組比較，除 A 和 B 處理組外，其余4 組云木香根際土中孢子密度均有所上升，其中F 組增加近2 倍。A 與B 處理組分別混合接種4 種不同AMF，結果卻顯示云木香根際土中孢子密度相較于CK 組有所下降；而其它組分別混合接種2 種不同AMF，結果顯示孢子密度卻有不同程度地增加，這說明同時接種過多AMF 可能會引起孢子密度降低，這可能是由于不同AMF 之間相互作用對孢子密度產(chǎn)生了抑制。由圖1 分析可知，混合接種2 種不同AMF 對根際土孢子密度的增加有促進作用，而混合接種2 種不同AMF 組合對孢子密度的增加也有所不同。由此可知，混合接種不同AMF 并不是越多越好，接種的同時要考慮不同AMF 菌種之間產(chǎn)生的協(xié)同或抑制作用以及這種機制對云木香孢子密度的影響，根據(jù)不同目的選擇不同的AMF 混合接種可以得到更理想的效果。

圖1 混合接種不同AMF后孢子密度的變化Fig. 1 Changes of spore density in mixed inoculation of differ?ent AMF

2.2 混合接種不同AMF 對云木香根系侵染率的影響

由圖2 可知，CK 組未被侵染，而混合接種不同AMF 的云木香根系均被100%侵染，但侵染強度有所不同，可能是由于云木香與混合菌種之間存在相互選擇的作用，其中D 組侵染強度最高。這說明云木香苗期外源混合接種不同AMF 能正常生長，且能和云木香根系形成良好的菌根共生體。

圖2 混合接種不同AMF后侵染率及侵染強度的變化Fig.2 Change of infection rate and intensity of mixed inocula?tion of different AMF

2.3 混合接種不同AMF 對云木香根際土壤養(yǎng)分和pH的影響

經(jīng)表2 分析可知，混合接種不同AMF 后，云木香根際土的pH 保持在6.12~6.21 之間，土壤環(huán)境呈弱酸性，與CK 組相近，證明外源混合接種不同AMF并未對云木香根際土壤環(huán)境的pH 產(chǎn)生顯著影響。與CK 組相比，除B 處理組外，其余處理組均使云木香根際土壤內(nèi)的速效氮、速效磷、有機質(zhì)和有機碳含量有所提高，其中，E 處理組的增長率最高，C 處理組次之?；旌辖臃NE處理組后云木香根際土上述指標依次增加93.02%、26.12%、43.40%和43.41%，混合接種C處理組后云木香根際土上述指標依次增加66.71%、23.37%、30.00%和29.99%。方差分析可知，E 處理組和C 處理組與CK 間差異均達顯著水平，這說明外源接種不同AMF 不僅可以與根系形成良好的共生體，還能夠增強土壤肥力。

表2 混合接種不同AMF后根際土壤養(yǎng)分含量和pH的變化Table 2 Changes of nutrient content and pH of rhizosphere soil treated by mixed inoculation of different AMF

2.4 混合接種不同AMF 對云木香根際土壤微生物數(shù)量的影響

外源混合接種不同AMF 后，云木香根際土壤中細菌和放線菌數(shù)量以及均顯著高于CK 組（表3）。其中，E 處理組的細菌和放線菌增長幅度最大，依次為66.20%和95.90%（P＜0.05），C 處理組的增長幅度次之，依次為61.97%和68.44%（P＜0.05）。而真菌的數(shù)量除B 處理組外，其余處理組均呈上升的趨勢。其中，C 處理組的真菌數(shù)量上升最多，與CK 相比，其增長率為58.25%。此外，外源混合接種C 處理組還可以顯著提高微生物總量，其增長率達到了67.72%。以上結果表明，混合接種不同AMF可以改善根際土壤微生物群落結構，使云木香根際土壤微生物群落表現(xiàn)為放線菌＞細菌＞真菌。

表3 混合接種不同AMF后根際土壤微生物數(shù)量的變化Table 3 Variation of microbial quantity in rhizosphere soil treated by mixed inoculation of different AMF

2.5 混合接種不同AMF 對云木香根際土壤酶活性的影響

混合接種不同AMF對云木香根際土壤酶活性的影響具有差異（表4），其中蛋白酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、過氧化氫酶及蔗糖酶的活性比CK組均有提高。蛋白酶可以促進土壤中含蛋白質(zhì)氮的有機化合物進行轉(zhuǎn)化為植物生長提供充足的氮源，而云木香苗期外源混合接種不同AMF可使各處理組的蛋白酶活性升高2~27倍。脲酶是唯一能水解尿素的酶，其活性高低直接反映了植物對氮素的轉(zhuǎn)化程度和直接利用情況。與CK組比較，各處理組脲酶變化呈現(xiàn)上升趨勢，僅有A、C兩組略微下降，其酶促產(chǎn)物是植物氮素另一主要來源，這說明混合接種不同AMF 對云木香根際土中氮素的積累奠定了基礎。土壤中磷酸酶活性是衡量土壤磷素生物轉(zhuǎn)化強度大小與方向的重要指標。本試驗中測定了不同pH磷酸酶的活性，除部分處理組中性磷酸酶活性略微下降，其余均為上升，這說明外源混合接種不同AMF 可以促進土壤中磷素的代謝過程。過氧化氫酶可以促進過氧化氫（H2O2）的分解，并能夠預防H2O2過度積累而對植物體造成毒害作用。本試驗處理組過氧化氫酶活性均上升，這提高了云木香免受H2O2的毒害能力，保證了其健康生長。蔗糖酶又名轉(zhuǎn)化酶，可以通過水解有機物增加土壤中易溶性營養(yǎng)物質(zhì)含量，為土壤中生物提供充足的光合作用產(chǎn)物，故蔗糖酶活性即可體現(xiàn)土壤生物學活性，也可以用來評價土壤肥力和土壤熟化程度。本試驗中除D 處理組有部分下降外，其余處理組蔗糖酶活性均有所上升。綜上所述，外源混合接種不同AMF均能顯著提高土壤肥力。

表4 混合接種不同AMF后根際土壤酶活性的變化Table 4 Changes of enzyme activity in rhizosphere soil treated by mixed inoculation of different AMF

2.6 相關性分析

經(jīng)過相關分析發(fā)現(xiàn)（表5），云木香根際土中的速效氮與速效磷、有機質(zhì)和有機碳含量之間呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數(shù)依次為0.949、0.944 和0.944；速效磷與有機質(zhì)和有機碳之間呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數(shù)均為0.957；有機質(zhì)與有機碳之間呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數(shù)為1.000。土壤中的各營養(yǎng)成分間均呈正相關，說明了各營養(yǎng)成分之間具有促進協(xié)同作用，對增強土壤肥力有重要意義。土壤內(nèi)微生物群落的數(shù)量及比例對植物的生長非常重要，云木香根際土中的細菌數(shù)量與放線菌數(shù)量呈顯著正相關（P＜0.05），相關系數(shù)為0.897，這說明細菌與放線菌數(shù)量的適當增加能保證云木香的健康生長。細菌數(shù)量與酸性磷酸酶活性之間呈顯著負相關（P＜0.05），相關系數(shù)為-0.885；真菌數(shù)量與中性磷酸酶活性之間呈顯著負相關（P＜0.05），相關系數(shù)為-0.897；脲酶活性與堿性磷酸酶活性之間呈顯著性負相關（P＜0.05），相關系數(shù)為-0.862。

表5 相關性分析Table 5 Correlation analysis

續(xù)表

3 討論

分析本研究結果可知，外源混合接種不同的AMF 能影響云木香根際土壤養(yǎng)分含量、土壤酶活性和微生物群落數(shù)量。AMF 通過侵染作用與宿主植物根系形成叢枝結構，這是其能與宿主植物形成良好共生關系的主要原因。共生關系體現(xiàn)在AMF 通過自身的生理代謝改善土壤環(huán)境，而宿主植物也能為AMF提供合適的寄生環(huán)境。

試驗組中6 種不同的AMF 組合對云木香根際土壤養(yǎng)分含量、土壤酶活性以及微生物數(shù)量產(chǎn)生的影響不同。與CK組相比，A、B處理組的孢子密度略有下降，而其余處理組均有不同程度地增加，這與何敏紅發(fā)現(xiàn)接種AMF 能顯著提高構樹種內(nèi)競爭下及種間競爭下孢子密度結果一致［19］。但A、B 組孢子密度下降同時也表明根際土壤中孢子密度的變化與接種的AMF 組成有關，混合過多AMF 可能會增強種間競爭而抑制根際土中孢子數(shù)量的增加。所有接種AMF 的處理組侵染率都達到100%，與谷文超等［20］研究結果相符，表明其與云木香根系形成了良好的菌根體系。在土壤養(yǎng)分的變化中，部分處理組速效氮與有機磷上升較為明顯，其中E 處理組速效氮含量上升近2倍，有機磷含量上升也最明顯。此外，與CK 組相比，有機碳和有機質(zhì)含量增加，試驗組土壤pH 變化不明顯，整體呈現(xiàn)弱酸性水平。土壤中的細菌可以參與土壤氨化作用和有機質(zhì)的分解；而放線菌能分解土壤中的有機物且能分泌抗生素，拮抗土壤中的病原菌，保護植株健康生長；真菌則可以參與腐殖質(zhì)的形成、有機質(zhì)的分解和土壤氨化作用等。外源混合接種AMF 后，云木香根際土壤微生物數(shù)量總體表現(xiàn)為放線菌＞細菌＞真菌。雖然三種微生物數(shù)量比CK 組均有增加，但細菌和放線菌增加最為明顯，也是優(yōu)勢群落。細菌和放線菌數(shù)量的顯著增加能改善土壤群落結構，增強植物激素、抗生素等的合成，對于云木香健康生長及抗逆性的增強有重要意義。土壤養(yǎng)分含量與土壤微生物群落結構的變化趨勢與周游等［9］對接種不同AMF 后的滇重樓土壤環(huán)境研究結果一致。土壤酶活性變化是植物生長過程中十分重要的指標，試驗測定的各種酶活性總體呈現(xiàn)上升趨勢。蔗糖酶、磷酸酶和脲酶活性的增加表明AMF 能促進有機物的轉(zhuǎn)化，也能加快土壤中含氮化合物和含磷化合物的降解，為植物的生長發(fā)育提供了充足的氮素和磷素。而過氧化氫酶的分解作用能使云木香免受H2O2的毒害。相關性分析中，土壤養(yǎng)分的速效氮和速效磷與有機質(zhì)和有機碳含量呈現(xiàn)極顯著正相關，表明土壤養(yǎng)分相互之間影響非常顯著，這對于云木香的生長培育非常有利。

綜上所述，混合接種不同AMF 能顯著影響云木香根際土壤養(yǎng)分含量、土壤酶活性以及微生物群落結構，混合接種不同的AMF 對云木香各項指標產(chǎn)生的影響有所不同。因此，應根據(jù)云木香生長培育的不同需求及栽培環(huán)境的不同，選擇接種不同的AMF組合以達到理想效果。上述研究成果能為藥用植物云木香的生長及AMF 資源利用提供一定的理論依據(jù)。