香水蓮花提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用

張 靜，侯北偉，姚正穎，張軒寧，孫力軍，張俊杰**

（1.江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇連云港222005；2.南京野生植物綜合利用研究所，江蘇南京211100）

尿酸是嘌呤代謝過程中的終產(chǎn)物，由于人體中不存在尿酸酶，其主要通過腎臟和腸道排泄尿酸。當人體內(nèi)嘌呤代謝紊亂或腎臟功能異常時，尿酸不易排出，從而會引發(fā)高尿酸血癥及一系列病癥［1］。高尿酸血癥可能會引起糖尿病、高血壓及冠心病等并發(fā)癥，同時血尿酸水平越高，發(fā)展為痛風的可能性也越大，尿酸鹽結晶沉積在患者的關節(jié)部位，造成關節(jié)紅腫變形，形成反復發(fā)作的痛風性關節(jié)炎［2］。目前，降尿酸主要通過促進尿酸排泄和抑制尿酸生成兩種途徑，臨床上用藥也多以此為依據(jù)［3-4］。

常見降尿酸藥物有丙磺舒、苯溴馬隆、磺毗酮等，通過抑制腎小管對尿酸的重吸收，促進尿酸的排出。別嘌醇片、非布司他、托匹司他屬于黃嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XOD）抑制劑，通過抑制酶活性，達到減少尿酸生成的效果。鑒于西藥可能的不良反應，例如皮疹、頭痛惡心等，嚴重者甚至會引起肝功能異常，近年來臨床上多采用中西醫(yī)結合治療的方法，常見的治療高尿酸血癥的中藥材有梔子、葛根、菊苣、金銀花、絞股藍等［5-6］。隨著XOD 抑制劑天然產(chǎn)物的研究，天然產(chǎn)品已成為新藥物的來源［7］。如紫蘇葉、藜蒿、拐棗、葛根、水芹等可食用植物［8-12］，對XOD 均有較高的抑制作用。目前，從天然植物中發(fā)現(xiàn)能夠治療高尿酸血癥和痛風的高效低毒成分逐漸成為研究熱點［13］。

香水蓮花（Nymphaeahybrid）是睡蓮科（Nympha?eaceae）水生宿根草本植物，屬于大型睡蓮類，具有較強的耐寒性，可全年不間斷地開花，產(chǎn)花量居世界“荷”或“蓮”之冠［14］。香水蓮花含有豐富的多酚、黃酮、粗多糖、生物堿、低聚糖和粗纖維等活性成分，其總黃酮提取物對酪氨酸酶活性具有抑制效果，可作為植物源美白劑用于化妝品行業(yè)［15］；多酚類提取物可清除自由基，抗氧化作用較強［16］；不同極性部位的提取物對胰脂肪酶也具有一定的抑制作用［17］。香水蓮花水提物對XOD 也有抑制作用，但其對XOD 的抑制動力學尚未有深入細致的研究。本研究以香水蓮花水提物為研究對象，利用分光光度法，建立XOD 抑制活力的體外評價體系，研究香水蓮花對XOD 的抑制動力學機制，并對比分析不同地區(qū)香水蓮花提取物抑酶活性的差異，以便為香水蓮花后續(xù)相關產(chǎn)品的研發(fā)提高理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色香水蓮花的花蕊干燥樣本分別于2019~2020 年收集購于安徽蕪湖、山東濟南、廣東中山、江蘇南京4 個地區(qū)；陽性對照樣品別嘌醇片購于合肥久聯(lián)制藥有限公司；黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶購于Sigma 公司；其他試劑均為分析純，購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

JA3103N 電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；WD-800A多功能粉碎機（永康市速鋒工貿(mào)有限公司）；KQ5200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-2000 旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器廠）；H-1650高速臺式離心機（湘儀離心機有限公司）；LGJ-25F 冷凍干燥機（四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司）；TU-1800 紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取物制備

將干燥樣本用粉碎機進行粉碎，過80目篩，密封保存?zhèn)溆?。稱取15 g粉末于瓶中，第1次按料液比1∶30加入450 mL蒸餾水，于60℃下超聲提取45 min，離心濾出上清液。將濾渣進行第2次提取，料液比為1∶20，其余步驟與上述相同。合并兩次濾液，進行離心、抽濾，得到澄清液體。利用旋轉蒸發(fā)儀將提取液蒸發(fā)至膏狀，冷凍干燥后研磨裝瓶備用。

1.3.2 提取物對XOD抑制能力的測定

樣品對XOD 活力的影響，可采用紫外分光光度法測定。尿酸的生成量和XOD 的活力成正比，利用紫外分光光度計對反應物進行全波長掃描，確定尿酸的特征吸收峰。在此波長下，測得的單位時間內(nèi)反應體系的吸光值變化，即尿酸生成量。

在10 mL 酶促反應體系中依次加入pH=7.5 磷酸鹽緩沖液、1.5 mmol/L 黃嘌呤溶液、7 mg/mL 提取物待測液、5 U/mL 酶溶液，充分混勻反應，具體加樣量見表1。在室溫25℃條件下于特征吸收峰處測定吸光值，每隔30 s讀取一次數(shù)值，持續(xù)10 min。以反應時間為橫坐標，吸光值為縱坐標作圖，直線斜率則表示反應速率（dA/min），即為酶活力。斜率越大，說明酶活力越強，dA為吸光度的增加值。

表1 XOD活力測定體系Table 1 XOD activity determination system

提取物對 XOD 的抑制率=（1-A/B）×100%，其中，A 是指樣品組反應體系中的酶活力；B 是指空白組反應體系中的酶活力。

1.3.3 提取物對XOD抑制作用的測定

在酶促反應體系中，保持黃嘌呤溶液濃度（1.5 mmol/L）不變，加入不同濃度的安徽蕪湖提取物（5、7、9 mg/mL），測定不同濃度的酶溶液對反應速率的影響。以酶濃度為橫坐標，反應速率為縱坐標作圖，得到相關曲線，以此判斷香水蓮花提取物對XOD的抑制作用。

1.3.4 提取物對XOD 抑制動力學及抑制常數(shù)的測定

保持參加酶促反應的各物質體積不變，固定酶濃度不變，依次改變黃嘌呤溶液濃度（0.375、0.75、1.5、3 mmol/L），在此條件下，測定不同濃度的安徽蕪湖提取物（5、7、9 mg/mL）對反應速率的影響。利用雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk），以黃嘌呤溶液濃度的倒數(shù)為橫坐標，反應速率的倒數(shù)為縱坐標作圖，確定香水蓮花提取物對XOD 的抑制類型，再根據(jù)抑制類型計算抑制動力學常數(shù)Ki。

1.3.5 不同地區(qū)提取物的抑酶能力比對分析

固定反應體系中的底物、酶濃度不變，分別測定不同濃度下安徽蕪湖、山東濟南、廣東中山、江蘇南京4 個地區(qū)提取物（5、7、9 mg/mL），別嘌醇（1、2、3 μg/mL）對XOD的抑制率，并對提取物濃度及抑制率進行回歸分析，得到半數(shù)抑制濃度IC50，對不同地區(qū)香水蓮花的抑酶活性進行對比分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

每個樣品平行測定3 次，計算平均值及標準偏差。試驗數(shù)據(jù)應用SPSS 22.0 進行回歸分析，計算IC50及Ki 值，采用Origin 6.0作圖。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

對反應體系中生成的物質進行全波長掃描。如圖1 可知，反應產(chǎn)物尿酸在295 nm 處有最大吸收峰，因此將295 nm作為試驗中的檢測波長。

圖1 反應產(chǎn)物尿酸紫外吸收光譜圖Fig.1 UV-absorption spectra of the reaction products

2.2 提取物對XOD抑制率的影響

在酶促反應體系中，以安徽蕪湖提取物濃度為自變量，抑制率為因變量作圖，對XOD 的抑制結果如圖2 所示。提取物濃度在3～5 mg/mL 時，抑制率隨著濃度的升高而呈線性增長，增長速度較快，不同濃度相互之間存在顯著性差異；在5～10 mg/mL時，隨著濃度的增加抑制率也隨之增加，但增長趨勢較小，相鄰濃度之間不存在顯著差異，但非相鄰濃度之間存在顯著性差異；當濃度大于10 mg/mL時，抑制率的增長漸趨平緩，2 個濃度之間不存在顯著性差異。

圖2 水提物對XOD抑制率的影響Fig.2 Effects of the water extracts inhibitory rate on XOD

2.3 提取物對XOD抑制作用的分析

在酶促反應體系中，固定黃嘌呤溶液濃度（1.5 mmol/L），測定提取物（5、7、9 mg/mL）在不同酶濃度下的反應速率。結果如圖3所示，直線都經(jīng)過原點，且隨著提取物濃度的增加，直線的斜率不斷降低，即反應速率減緩，說明了提取物對XOD 的抑制作用是可逆性抑制。

圖3 水提物對XOD的抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of water extract on XOD

2.4 提取物對XOD的抑制動力學分析

2.4.1 提取物對XOD抑制類型的確定

在酶促反應體系中，保持酶濃度不變，測定不同濃度提取物（5、7、9 mg/mL）在不同濃度黃嘌呤溶液（0.375、0.75、1.5、3 mmol/L）下的反應速率。利用雙倒數(shù)法作圖，以反應速率倒數(shù)［1/V］為縱坐標，底物黃嘌呤溶液濃度倒數(shù)［1/S］為橫坐標。如圖5 可知，不同濃度提取物所做出的直線相交于縱軸上的一點，且交點位置幾乎并未隨濃度的變化而改變，即Vmax保持不變，直線斜率逐漸增大，表明提取物對XOD的抑制類型屬于競爭性抑制。

圖4 水提物抑制XOD的雙倒數(shù)圖Fig.4 Lineweaver-Burk plot of inhibition of XOD by thewater extract

圖5 水提物對XOD抑制常數(shù)的測定Fig.5 Determination of inhibition constant of the water extract on XOD

2.4.2 抑制常數(shù)Ki的確定

在黃嘌呤溶液濃度為0.75、1.5 mmol/L 的反應體系中，以提取物濃度為橫坐標，反應速率倒數(shù)為縱坐標，得到圖6。圖中兩條直線相交于一點，計算出該點的值即為Ki。因此，提取物對XOD 的Ki為2.01 mg/mL。

2.5 不同地區(qū)香水蓮花抑酶效果比較

2.5.1 不同地區(qū)香水蓮花提取率

對4 個地區(qū)收集的紫色香水蓮花進行超聲提取，提取率見圖6。4 個地區(qū)的提取物中，山東濟南水提物提取率最高為（40.63±0.23）%；江蘇南京的提取率最低為（23.97±0.14）%。

圖6 不同地區(qū)香水蓮花的提取率Fig.6 Extraction rate of Nymphaeahybrid from different regions

2.5.2 不同地區(qū)香水蓮花抑酶效果

在酶促反應體系中，保持其他條件不變，以提取物濃度為自變量，抑制率為因變量，計算不同地區(qū)提取物對XOD的半數(shù)抑制濃度IC50，以別嘌醇作為陽性對照組，結果見表2。陽性對照品別嘌醇的IC50為0.015 μg/mL，顯著優(yōu)于香水蓮花的抑制效果。提取物的抑制效果因為地區(qū)環(huán)境的不同而呈顯著性差異，其中廣東中山提取物抑制效果最好，IC50為64.72 μg/mL；其次為江蘇南京的樣品，IC50為112.16 μg/mL。

表2 提取物和別嘌醇對XOD的半數(shù)抑制濃度Table 2 IC50 values of allopurinol and extract from Nymphaea?hybrid in different regions

3 討論

3.1 香水蓮花提取物對XOD的抑制類型

XOD 是一種黃素蛋白酶，存在于各種生物體中，能夠催化黃嘌呤和次黃嘌呤生成尿酸。當人體內(nèi)尿酸濃度過高時，會引發(fā)高尿酸血癥。從植物中提取XOD 抑制劑，在治療高尿酸血癥上可以彌補傳統(tǒng)西藥毒副作用大以及不能久服的難題。XOD 抑制劑的來源很多，包括黃酮類物質、多酚類物質，甚至食物蛋白源的活性肽對XOD 均有抑制作用［18］。在抑制類型上，不同提取物或化合物對XOD 的抑制作用類型也不盡相同。白藜蘆醇和橙皮苷等多酚單體［19］，紫蘇葉醇提物［8］及辣木葉醇提物［20］等對XOD 的抑制均屬于競爭性抑制；多肽Pro-Pro-Lys-Asn-Trp 對 XOD 的作用是非競爭性抑制［18］；而水芹醇提物［12］、金雀花根醇提物［21］對XOD 的抑制類型為混合型抑制。

香水蓮花水提物對XOD 的抑制屬于競爭性抑制，它們與底物競爭酶的結合部位，但對酶－底物絡合物不影響，增加底物濃度可以消除這種抑制作用。提取物對XOD 的抑制作用都是呈劑量依賴的，隨著抑制劑濃度的增加，抑制作用增強，到達一定濃度后，抑制率漸趨平穩(wěn)。同時，提取物并不能使XOD 徹底失活，對其抑制作用是可逆的，通過一些物理手段除去抑制劑后，酶的活力會恢復。對酶抑制類型的研究，有助于了解其作用機理。

3.2 不同地區(qū)香水蓮花對XOD抑制作用的差異

香水蓮花不同來源地的樣本，不論提取率還是對XOD 的抑制作用均存在一定的差異性。山東濟南提取率最高為（40.63±0.23）%，但其對XOD 的抑制作用僅高于安徽蕪湖的樣本。提取率及對XOD的抑制作用與地理分布也沒有相關性，江蘇南京與安徽蕪湖地理距離較近，但前者抑制作用優(yōu)于后者，而后者提取率又優(yōu)于前者。結果表明地區(qū)環(huán)境差異對植物的活性成分的積累有關系，進而影響其抑酶活性的效果。不同種植區(qū)域和不同采收期對香水蓮花抑酶活性的影響還有待進一步分析，其有效的活性抑制成分也有待進一步研究。

廣東中山提取物的 IC50為 64.72 μg/mL，在 4 個地區(qū)中抑制效果最佳，但將其與藥物別嘌醇（IC50為0.015 μg/mL）相比，別嘌醇抑制效果顯著優(yōu)于香水蓮花提取物。但別嘌醇具有一定的副作用，在臨床上治療高尿酸血癥及痛風時可以適量使用香水蓮花提取物作為XOD 抑制劑以減少別嘌醇的使用劑量，從而減輕后者對患者的毒副作用。香水蓮花提取物可作為XOD抑制劑的開發(fā)新來源。