動物源功能性芽孢桿菌的篩選與鑒定

朱永明，王倩，郗艷菊★，郭永紅，吳國江

（1.河北維爾利動物藥業(yè)集團有限公司 050227；2.河北農業(yè)大學 生命科學學院 071001；3.河北省功能性飼料添加劑技術創(chuàng)新中心 050200；4.石家莊市獸用功能性添加劑工程技術中心 050200）

隨著養(yǎng)殖端減抗、限抗政策的推行，微生態(tài)制劑、中藥等行業(yè)開始占據主導地位，其中益生菌作為動物保健品，具有調理腸道，維持腸道微生態(tài)平衡，促進生長等優(yōu)點，被認為是最具有潛力的減抗、限抗的主力軍之一。

腸道微生物種類繁多，構成了多樣性的微環(huán)境，其中存在400～500多種微生物與宿主共生，至少有1000多個菌落形成單位[1]。正常情況下，在一定的生理范圍內，微生態(tài)區(qū)系隨著外界環(huán)境和飲食的改變而變動，幼齡畜禽容易受到應激影響，易導致微生態(tài)環(huán)境失調。調整并保障畜禽的消化道微生態(tài)平衡，是畜禽健康養(yǎng)殖的前提條件。

本研究從健康家禽腸道中，篩選對致病大腸桿菌具有顯著拮抗作用的且能產多種酶系的多功能芽孢桿菌作為目的菌株。芽孢桿菌可以消耗腸道內的氧氣，造成厭氧環(huán)境，利于乳酸菌、雙歧桿菌等厭氧有益菌的增殖，從而調整腸道菌群的平衡，減少腸毒素的產生，促進腸道的免疫和營養(yǎng)吸收功能，進而達到降低家禽腹瀉率，提高家禽生產性能的和飼料報酬率的目的[2]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

致病性大腸桿菌（Eacterium coli ATCC 53832），由河北農業(yè)大學生命科學學院保存并提供。

從石家莊、保定、滄州等地養(yǎng)殖場采集健康家禽新鮮糞便，冷藏備用。

NB 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、NA 培養(yǎng)基的組成參考文獻[3]，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成參考尚偉(2012)[4]。

蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶鑒別培養(yǎng)基的配置參考文獻[5-7]

生理生化特性試驗所用試液的配制參考文獻[8]。

1.2 儀器設備

MLS-3020高壓滅菌鍋，SANYO公司；SPX-250智能生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽征實驗儀器廠；電子天平（Adventurer），OHAUS USA；電熱恒溫干燥箱，SANYO公司；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司制造廠；BC/BD-325型低溫冰箱，海爾公司；123MB-1型光學顯微鏡，Nikon；ZHWY-211B雙層搖床，上海智誠分析儀器有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機，湖南賽特湘儀器公司。

2 試驗方法

2.1 益生菌菌株的分離

取新鮮家禽糞便1 g溶于10 mL無菌水中，振搖使其充分混合，85 ℃水浴20 min，然后用無菌水10倍梯度稀釋，取3個適當稀釋梯度（10-2～10-6）的懸液在平板上涂布，每個稀釋度涂布3個平板，37 ℃培養(yǎng)24 h獲得單菌落。挑取形態(tài)不同的菌落分別在NA瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種做純培養(yǎng)，做好標記。

2.2 病原菌平板的制備

取1支裝有5.0 mL無菌水的試管，將無菌水倒入活化好的病原菌（大腸桿菌）斜面試管內，用滅菌竹簽輕輕將病原菌刮下，形成的菌懸液再倒入盛無菌水的試管中，用漩渦振蕩器振蕩1 min后，分別倒入盛有100 mL、約50℃的NA培養(yǎng)基的三角瓶中?；靹蚝蠓謩e立刻倒入雙碟平板（直徑9 cm），每個平板倒入約15 mL，冷卻后標記病原菌平板種類，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 芽孢桿菌的初篩和復篩

挑取不同形態(tài)的單菌落分別轉接到病原菌平板上與病原菌進行生長對峙試驗，測量菌落直徑和抑菌圈直徑，并以后者與前者之比計算圈徑比，將產生較大抑菌圈的菌株保存于NA斜面，得到復篩菌株。

將復篩菌株分別接種于裝瓶量50 mL/250 mL的NB培養(yǎng)基中，37℃，180 r·min-1培養(yǎng)12 h作為種子液。將種子液按2%接種量接種于裝瓶量為50 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h，即得發(fā)酵液。將發(fā)酵液10000 r·min-1離心20 min，取上清液。以瓊脂打孔擴散法測定各菌株發(fā)酵液對大腸桿菌的抑菌活性。

制備牛奶平板、淀粉平板、纖維素平板，以瓊脂打孔擴散法檢測各峰是否是蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶。若牛奶平板出現(xiàn)透明圈則證明含有蛋白酶；若用碘液加入到淀粉平板，出現(xiàn)透明圈則證明含有淀粉酶。若牛奶平板出現(xiàn)透明圈則證明含有蛋白酶。若用剛果紅染液滴加到纖維素平板，出現(xiàn)透明圈則證明含有纖維素酶。篩選抑菌圈和酶解圈較大且酶系較全的菌株保存?zhèn)溆米鳛樽罱K篩選菌株，進行后續(xù)鑒定和檢測等相關工作。

2.4 芽孢桿菌菌株的種屬鑒定

2.4.1 菌落和菌體形態(tài)觀察

將篩得的菌株劃線接種于NA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落的大小、表面、邊緣、透明度、隆起形狀等形態(tài)特征。以革蘭氏染色法觀察菌體形態(tài)和芽孢形態(tài)。

2.4.2 生理生化特性測定

生理生化特性試驗參考文獻[5]中相關內容進行。

2.4.3 16S r DNA序列分析

參照文獻[9]進行功能性菌株總DNA的提取，并進行16S rDNA的擴增。將PCR產物送至華大基因測序，將所測出的16S rDNA序列提交到GeneBank中進行BLAST比對，選取相似性較高的模式菌株序列，利用Mega 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 試驗結果及分析

3.1 功能性菌株的篩選結果

拮抗大腸桿菌的芽孢桿菌篩選結果見表1，經NA培養(yǎng)基從雞糞中分離得到的86株菌株，經大腸桿菌的拮抗試驗，初篩得到10株圈徑比大于1.50的菌株，其中B-4M-6菌株圈徑比達到最大，為2.20。經瓊脂打孔擴散法檢測抑制大腸桿菌抑菌圈較大的菌株為B-4M-6和J-4M-26，抑菌圈面積分別可達237.6mm2和224.5mm2。因此篩選出B-4M-6和J-4M-26進行酶解圈的試驗驗證。

表1 拮抗大腸桿菌篩選結果

B-4M-6和J-4M-26進行酶解圈的試驗結果見表2所示，B-4M-6菌株產淀粉酶、產纖維素酶和產蛋白酶能力明顯優(yōu)于J-4M-26菌株，因此最終選擇B-4M-6菌株進行后續(xù)試驗。

表2 篩選菌株酶解試驗結果

將B-4M-6菌株進行拮抗大腸桿菌和產酶效果的驗證見圖1所示，B-4M-6菌株具有拮抗大腸桿菌和產淀粉酶、產蛋白酶和產纖維素酶的功能。

圖1 B-4M-6菌株功能性驗證

3.2 功能性菌株的鑒定

3.2.1 B-4M-6菌株的菌落與菌體形態(tài)觀察

篩選出的功能性菌株B-4M-6的菌落、菌體和芽孢形態(tài)見圖2，菌落中等大小，圓形，邊緣不整齊不規(guī)則，白色不透明，表面干燥，呈高火山口狀；菌體呈桿狀，革蘭氏陽性菌，芽孢中生、端生，呈橢圓形及圓柱形。

圖2 B-4M-6菌株的菌落、菌體和芽孢形態(tài)

3.2.2 B-4M-6菌株的菌株的生理生化試驗

根據《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對B-4M-6菌株進行生理生化試驗，結果見表3。根據菌株生理生化試驗結果，結合形態(tài)學特征可初步判斷B-4M-6菌株特征為芽孢桿菌屬菌株。

表3 B-4M-6菌株的生理生化試驗結果

3.2.3 B-4M-6菌株16SrDNA鑒定

提取B-4M-6菌株的16Sr DNA進行PCR擴增，結果如圖3所示，電泳結果顯示各菌株序列長度均在1500bp左右。

圖3 B-4M-6菌株的16SrDNA的PCR產物電泳圖

將B-4M-6菌株16S rDNA的測得序列與相應高同源性的標準菌株的16S rDNA構建系統(tǒng)進化樹（見圖4），并進行相似性比較（見表4）。由結果可知，B-4M-6菌株與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）同源且相似性最高。故鑒定B-4M-6菌株為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。

圖4 B-4M-6菌株的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 B-4M-6菌株16S rDNA序列與高同源菌株的相似性比較

4 討論

解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌有很高的親緣性[10]，可胞外產生蛋白酶[11]、脂肪酶[12]、纖維素酶[13]、淀粉酶[14]等多種消化酶。白海等[15]從綿羊糞便中篩選得到一株枯草芽孢桿菌，安全無毒害作用，具有促進綿羊生產得特點。何深宏等[16]從牛糞中篩選得到一株高產纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌，產纖維素酶活力可達31.9U/mL，可用于牛糞無害化降解。史媛媛等[17]從秸稈有機肥和土壤等自然環(huán)境中取樣，以模擬胃腸道環(huán)境對分離菌株進行篩選，獲得了耐膽鹽、產蛋白酶和淀粉酶的解淀粉芽孢桿菌B9。

芽孢桿菌具有抗逆性強的優(yōu)點，在逆境條件下能產生特殊性休眠體，當環(huán)境條件恢復后，能快速的復蘇，增殖，因此具有廣闊的應用前景。據報道，芽孢桿菌能夠抑制致腹瀉病原菌的增殖，適合作為活菌制劑的微生態(tài)制劑菌種。某些芽孢桿菌能產抗菌肽，對大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌、魏氏梭菌等引起幼齡動物腹瀉的病原菌具有顯著的抑制作用[18]。目前，畜牧業(yè)主要應用的有解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等[19]。本研究從雞腸道中篩選得到1株可抑制致病性大腸桿菌且具有產酶能力的益生菌株B-4M-6，有望作為功能性微生態(tài)飼料添加劑應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。

5 結論

從健康青年雞的糞便中篩選出一株拮抗大腸桿菌能力較強的菌株，經鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），該功能性菌株具有產蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的能力，可用于改善動物腸道健康。