大麻素受體在子宮腺肌病在位內(nèi)膜中的表達*

汪 沙 段 華 沈 雪

(首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心，北京 100006)

子宮腺肌病是指具有生物活性的子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)侵入子宮肌層所致的局灶性或彌漫性病變[1]，是婦科常見的難治性疾病，主要表現(xiàn)為痛經(jīng)、月經(jīng)異常和不孕。子宮腺肌病的病因機制尚不明確，雖然基底內(nèi)膜腺體內(nèi)陷學說指出子宮內(nèi)膜基底層可能因妊娠或外力機械等因素受損，為子宮內(nèi)膜進入肌層生長提供條件，但是在位內(nèi)膜侵入肌層并生長的方式目前還不甚清楚[2]。

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(endocannabinoid system，ECS)由一系列內(nèi)源性生物活性脂質(zhì)(也稱為內(nèi)源性大麻素)、特異性內(nèi)源性大麻素受體和負責內(nèi)源性大麻素合成、轉(zhuǎn)運和降解的酶組成[3,4]。大麻素受體是存在于細胞膜或細胞質(zhì)內(nèi)的可與內(nèi)源性大麻素結合促其在體內(nèi)發(fā)揮生物學作用的一類特殊蛋白質(zhì)，現(xiàn)公認的主要包括1型大麻素受體(cannabinoid receptor 1，CB1)和2型大麻素受體(cannabinoid receptor 2，CB2)兩種類型，均屬于非特異性G蛋白耦聯(lián)受體家族[4]。

已有研究報道ECS參與子宮內(nèi)膜異位癥細胞增殖凋亡的調(diào)節(jié)、細胞侵襲和遷移、免疫炎性狀態(tài)、病灶神經(jīng)支配和疼痛的感知等[5,6]。此外，還被證實可影響多種腫瘤的血管生成過程和纖維化疾病的纖維化進程[7,8]。然而，關于ECS在子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展中的作用鮮有報道。為此，本研究初步通過檢測ECS的主要成分CB1和CB2受體在子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜中的表達情況，并與正常子宮內(nèi)膜組織中大麻素受體的表達水平進行對比，以探討大麻素受體對腺肌病發(fā)生的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準(2016-KY-012-01)，患者信息采集及標本收集均于術前獲得患者充分知情同意并簽署知情同意書。

選擇2017年7月～2018年12月45例因彌漫型子宮腺肌病于我院婦科微創(chuàng)中心行全子宮切除術的子宮內(nèi)膜標本為腺肌病組，組織病理診斷彌漫型子宮腺肌病，無子宮內(nèi)膜病變；同期34例因?qū)m頸疾病(宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級16例，宮頸癌ⅠA期18例)切除子宮的子宮內(nèi)膜標本作為對照，組織病理診斷宮頸疾病，無子宮腺肌病，無子宮內(nèi)膜病變。2組均排除盆腔炎、生殖系統(tǒng)發(fā)育異常等疾病，排除合并內(nèi)分泌、免疫代謝性疾病，排除術前3個月內(nèi)曾使用性激素類藥物治療或?qū)m內(nèi)節(jié)育器。

子宮腺肌病組45例，對照組34例。2組年齡分別為(46.0±3.8)歲(37～53歲)和(44.2±5.0)歲(32～53歲)(t=1.820，P=0.078)。子宮腺肌病組中子宮內(nèi)膜處于增殖期23例，分泌期22例，對照組增殖期22例，分泌期12例(χ2=1.460，P=0.227)。2組子宮體積分別為(255.5±205.3)mm3和(83.9±44.2)mm3(t=7.922，P=0.000)。

1.2 方法

1.2.1 組織取材 2組子宮切除后立即由專人進行組織取材，于無菌條件下自子宮前壁“Y”形剖開，兩側(cè)直達宮角，留取宮腔在位內(nèi)膜1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，用生理鹽水沖洗去掉血液后分為兩份，一份置于10%中性福爾馬林溶液中24小時用于制備石蠟切片，另一份置入液氮中迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存用于提取RNA。

1.2.2 免疫組化二步法染色檢測CB1和CB2蛋白表達 組織標本常規(guī)固定脫水、石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片制片。切片于60 ℃烤片2 h，二甲苯及梯度乙醇常規(guī)脫蠟，乙二胺四乙酸(EDTA)高壓修復抗原，3%H2O2去離子水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，3%山羊血清封閉，輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加磷酸緩沖鹽溶液(PBS)按一定比例配好的一抗(CB1稀釋比例1∶300；CB2稀釋比例1∶100)，4 ℃孵育過夜。滴加即用型免疫組化試劑盒中的多聚酶結合物和放大劑，室溫孵育，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)避光顯色，鏡下觀察染色情況；蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。陰性對照以磷酸鹽緩沖液代替一抗進行孵育。由2位觀察者對染色結果進行盲式閱片，蘇木素染細胞核為藍色，DAB顯出的陽性表達為棕黃色。通過Image pro plus 6.0圖像分析軟件對免疫組化結果進行分析，在400倍視野下檢測內(nèi)膜組織陽性染色部位的平均光密度值(mean optical density，MOD)進行定量分析。

1.2.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測CB1和CB2 mRNA表達 應用RNA提取試劑盒(日本Takara公司)提取細胞總RNA，以10 μl體系反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進行PCR反應擴增。CB1和CB2及內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因序列通過Gene Bank獲得。引物設計和合成由上海生工生物科技有限公司完成，引物序列見表1。qRT-PCR反應采用7500 Real Time PCR儀(美國ABI公司)，擴增反應采用三復孔。PCR擴增參數(shù)：95 ℃、10 min，1個循環(huán)；94 ℃、30 s，55 ℃、60 s，72 ℃、30 s，共40個循環(huán)。生成定量標準曲線圖，計算機軟件分析循環(huán)閾值(Ct值)，通過2-ΔCt相對定量法[9]，計算目的基因mRNA的相對表達量，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)。每個樣品重復3次，取3次平均值。

表1 qRT-PCR技術檢測CB1和CB2的引物序列

2 結果

2.1 子宮內(nèi)膜中CB1和CB2蛋白的分布

不論是腺肌病組還是對照組，CB1蛋白除了子宮內(nèi)膜腺上皮細胞外，還表達于間質(zhì)細胞，但在子宮內(nèi)膜腺上皮的表達強于間質(zhì)。分布主要在細胞漿，呈棕黃色顆粒(圖1)。與CB1蛋白類似，CB2蛋白亦廣泛表達于2組子宮內(nèi)膜組織中，以子宮內(nèi)膜腺上皮的表達為最強，主要分布在細胞漿，呈棕黃色顆粒(圖2)。

圖1 CB1蛋白的免疫組化染色：A、B分別為增殖期和分泌期的腺肌病組在位內(nèi)膜，C、D分別為增殖期和分泌期的對照組正常內(nèi)膜，棕黃色顆粒為陽性染色(×400，標尺5 μm) 圖2CB2蛋白的免疫組化染色：A、B分別為增殖期和分泌期的腺肌病組在位內(nèi)膜，C、D分別為增殖期和分泌期的對照組正常內(nèi)膜，棕黃色顆粒為陽性染色(×400，標尺5 μm)

2.2 2組CB1和CB2蛋白表達的比較

2組CB1、CB2蛋白表達的比較見表2。CB1蛋白在腺肌病組增殖期、分泌期在位內(nèi)膜中表達量(MOD值)均低于對照組；腺肌病組CB1蛋白在增殖期與分泌期的表達差異無統(tǒng)計學意義，而對照組增殖期低于分泌期。CB2蛋白在腺肌病組增殖期、分泌期在位內(nèi)膜中表達量均低于對照組；2組CB2蛋白的表達增殖期均低于分泌期。

表2 2組CB1蛋白、CB2蛋白表達量(MOD值)的比較

2.3 2組CB1和CB2 mRNA表達的比較

2組CB1、CB2 mRNA相對表達水平的比較見表3。CB1 mRNA在腺肌病組增殖期、分泌期在位內(nèi)膜中的表達量均低于對照組；腺肌病組CB1 mRNA在增殖期與分泌期的表達差異無統(tǒng)計學意義，而在對照組中增殖期低于分泌期。CB2 mRNA在腺肌病組增殖期、分泌期在位內(nèi)膜中的表達量均低于對照組；2組CB2 mRNA的表達增殖期均低于分泌期。

表3 2組CB1、CB2 mRNA相對表達水平的比較

3 討論

3.1 CB1和CB2與腺肌病發(fā)生發(fā)展的關系

目前有關ECS在子宮腺肌病中的研究有限。本研究結果顯示，與正常子宮內(nèi)膜相比，不論是增殖期還是分泌期，大麻素受體CB1和CB2在子宮腺肌病患者的在位內(nèi)膜中的表達均下降，提示ECS可能參與腺肌病的發(fā)生發(fā)展。Resuehr等[10]的研究也顯示CB1的表達在對照組的分泌期最高，不論在增殖期還是分泌期，CB1的表達在子宮內(nèi)膜異位癥的內(nèi)膜組織中最低。

有關ECS在生殖領域中的研究表明，ECS可能受性激素的影響[11,12]。Di Blasio等[13]通過文獻綜述了影響大麻素活性的脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)、N酰基磷脂酰乙醇胺-磷脂酶D(NAPE-PLD)以及大麻素受體CB1和CB2在女性生殖系統(tǒng)中的表達水平都隨著性激素而變化。這些報道與我們觀察到的正常內(nèi)膜中CB1和CB2的表達呈月經(jīng)周期性差異一致。ECS的這種周期性改變對正常生育功能的維持至關重要[14]。

3.2 CB1和CB2參與腺肌病發(fā)生發(fā)展的過程和臨床意義

子宮腺肌病通常被認為是一種雌激素依賴性疾病，主要病理特征為炎性、纖維化、神經(jīng)血管生成和子宮收縮異常[15]。多項研究證實大麻素受體在炎癥調(diào)節(jié)中起著重要作用[16,17]。Iuvone等[18]的研究顯示，大麻素受體存在于炎性子宮內(nèi)膜組織中，且CB2的選擇性活化與子宮內(nèi)膜炎癥中的一氧化氮釋放過程有關。ECS和免疫系統(tǒng)之間的相互作用可能會影響胚胎植入過程中有關生物進程的調(diào)節(jié)[19,20]。ECS可通過調(diào)節(jié)細胞因子、趨化功能和增殖能力參與多種免疫細胞系的調(diào)節(jié)，而這些免疫細胞對于維持正常的妊娠非常重要[21]?；谏鲜鲎C據(jù)和我們觀察到的結果，我們推測在子宮腺肌病的子宮內(nèi)膜組織中CB1和CB2的表達降低可能與免疫炎性狀態(tài)改變及腺肌病相關性不孕有關。

此外，動物研究已經(jīng)證實CB1和CB2的上調(diào)可以選擇性地抑制子宮肌層的自發(fā)性收縮，如果在人的子宮中存在類似的機制，那么子宮腺肌病患者中存在的異常子宮收縮亦可以通過激活這2種受體來緩解[22]。至于前面提到的子宮腺肌病的其他病理特征，亦有研究證實針對大麻素受體CB1或CB2的靶向治療，可以在多種纖維化疾病中發(fā)揮抗纖維化的作用[23]。大麻素受體也被證實參與腫瘤的血管生成和侵襲進程[7]。此外，有研究顯示CB1受體在子宮內(nèi)膜異位癥的動物模型中可以促進子宮內(nèi)膜異位癥神經(jīng)支配和異位病灶的生長[24]。

本研究中我們還觀察到大麻素受體CB1和CB2在子宮腺肌病的表達并不完全一致，CB2在腺肌病組和對照組都存在孕激素依賴性，表達量在分泌期高于增殖期，而CB1的表達在子宮腺肌病的內(nèi)膜組織中失去月經(jīng)周期性改變。這一點與Resuehr等[10]的報道一致，他們認為內(nèi)膜CB1的表達呈孕激素依賴性，而在子宮內(nèi)膜異位癥病人中該月經(jīng)周期性差異被打斷。通過與CB2的對比，我們所觀察到的子宮腺肌病內(nèi)膜中CB1喪失了月經(jīng)周期性改變可能表明它在腺肌病的發(fā)病機制中比CB2發(fā)揮著更為重要的作用。本研究為進一步明確子宮腺肌病的病理機制提供理論依據(jù)，同時也為延緩子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展提供潛在治療靶點。

本研究也存在一些局限性：首先，這只是一項初步的觀察性研究，尚需更多功能性研究來驗證CB1在子宮腺肌病發(fā)病機制中的作用；其次，樣本量的不足可能會掩蓋一些潛在的差異。因此，更大樣本量的功能性研究有助于進一步闡明這一問題。