MEG3-miR-455-PI3K/Akt信號通路對大腦中動(dòng)脈閉塞小鼠模型缺氧損傷神經(jīng)干細(xì)胞的影響

王 衡，陳 蓉，白瑞瑞，于奇晉，姜 進(jìn)，李定安

腦梗死是危害人類健康的重要原因之一，而神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的增殖及分化在腦梗死等缺血性腦血管疾病中發(fā)揮重要作用，缺氧時(shí)間的延長可促進(jìn)NSCs凋亡[1]。目前關(guān)于NSCs在缺氧中的作用機(jī)制尚未闡明。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)在神經(jīng)系發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，研究表明LncRNA可調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞分化過程[2-4]。LncRNA母系表達(dá)基因3(LncRNA MEG3)在神經(jīng)細(xì)胞缺血缺氧模型中表達(dá)升高，母系表達(dá)基因3(MEG3)可促進(jìn)缺血缺氧造成的小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡[5]。但MEG3對小鼠腦梗死缺氧神經(jīng)干細(xì)胞損傷的影響尚未可知。生物信息學(xué)分析顯示微小RNA-455(microRNA-455，miR-455)可能是MEG3的靶基因，研究表明，miR-455在氧糖剝奪神經(jīng)細(xì)胞和大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)小鼠腦組織中呈低表達(dá)，并可抑制缺血性腦卒中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[6]。相關(guān)報(bào)道指出，磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，Akt)信號通路可能與腦梗死大鼠腦損傷、血管新生和氧化應(yīng)激有關(guān)[7]。本研究通過構(gòu)建MCAO小鼠模型，觀察MEG3、miR-455在MCAO模型中的表達(dá)水平，原代分離與培養(yǎng)NSCs并進(jìn)行缺氧處理構(gòu)建NSCs缺氧損傷模型，檢測細(xì)胞中MEG3與miR-455的表達(dá)水平，探究MEG3表達(dá)變化對NSCs增殖、分化、凋亡及氧化應(yīng)激的影響，初步分析其對miR-455及PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用，以揭示NSCs缺氧損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級健康雄性C57BL/6小鼠36只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號為SCXK(滬)：2016-0003。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher公司；Lipofectamine2000與Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；MEG3小干擾RNA(si-MEG3)、亂序無意義陰性對照(si-con)、miR-455模擬物(mimics)、陰性對照(miR-con)、miR-455特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-455)及其陰性對照(anti-miR-con)購自廣州銳博生物科技有限公司；PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002購自美國Sigma公司；甲基噻唑基四唑(MTT)購自北京百奧萊博科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠CyclinD1、p21抗體購自上海善然生物科技有限公司；兔抗鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)抗體購自美國Abcam公司；兔抗鼠神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、Ⅲ型β微管蛋白(β-tubulin-Ⅲ)抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗鼠磷酸化磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶 B(p-AKT)購自美國GeneTex公司；兔抗鼠PI3K、Akt抗體購自美國Epitmics公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司；RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)、二烷基硫酸鈉(SDS)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MCAO模型建立 將18只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組與MCAO組，每組9只。MCAO模型：使用65 mg/kg的氯胺酮與6 mg/kg的甲苯噻嗪經(jīng)腹腔注射入小鼠體內(nèi)行急性麻醉處理，參照相關(guān)文獻(xiàn)制備MCAO模型，以缺血期血流降至基線水平25%以下且灌注期血流恢復(fù)至80%以上視為建模成功[8]。假手術(shù)組：除不用尼龍線栓外，其余步驟同MCAO組。切除各組小鼠全腦組織，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3.2 NSCs分離及培養(yǎng) 取18只小鼠(月齡6周)，采用脫頸法處死小鼠，75%乙醇消毒，取小鼠大腦，剔除腦膜等結(jié)締組織，鹽溶液清洗，將腦組織剪成1 mm3的碎塊，加入0.25%胰蛋白酶消化15 min，采用200目篩網(wǎng)過濾，4 ℃條件下經(jīng)1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清，收集細(xì)胞，參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行培養(yǎng)及傳代，收取第4代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[9]。

1.3.3 建立缺氧NSCs損傷模型及實(shí)驗(yàn)分組 收集NSCs接種于無糖DMEM培養(yǎng)基(5×105個(gè)/mL)，置于缺氧盒內(nèi)，通入5% CO2與95% N2混合氣體1 h后，關(guān)閉氣體，取出細(xì)胞[10]。將正常培養(yǎng)的NSCs作為對照組，缺氧處理的NSCs作為模型組。取對數(shù)生長期NSCs，分別將si-MEG3、si-con、si-MEG3與 anti-miR-455共轉(zhuǎn)染至NSCs，轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行缺氧處理，分別作為Hypoxia+si-MEG3組、Hypoxia+si-con組、Hypoxia+si-MEG3+anti-miR-455組。為探究MEG3對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用，分別將si-MEG3轉(zhuǎn)染至NSCs后使用濃度為50 μmol/L的LY294002處理24 h[11]，隨后缺氧處理，作為Hypoxia+si-MEG3+LY294002組。為探究MEG3是否通過靶向miR-455調(diào)控PI3K/Akt信號通路，分別將si-con、si-MEG3、si-MEG3與anti-miR-con、si-MEG3與anti-miR-455共轉(zhuǎn)染至NSCs，分別記作si-con組、si-MEG3組、si-MEG3+anti-miR-con組及si-MEG3+anti-miR-455組，轉(zhuǎn)染方法同上。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測細(xì)胞中MEG3、miR-455表達(dá)水平 采用Trizol法提取假手術(shù)組、MCAO組、對照組、模型組及轉(zhuǎn)染組NSCs中的總RNA，應(yīng)用Nanodrop 2000 c超微量分光光度計(jì)檢測RNA濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正向、反向引物0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min循環(huán)1次，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40次。MEG3以β-actin為內(nèi)參，miR-455以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算MEG3、miR-455相對表達(dá)量。

1.3.5 MTT檢測細(xì)胞增殖 收集各組NSCs接種于96孔板，按照1.3.3中程序分組處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液每孔20 μL，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，4 ℃條件下經(jīng)1 300 r/min離心5 min，棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)每孔150 μL，室溫避光振蕩、孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 收集各組NSCs，0.25%胰蛋白酶消化后離心1 000 r/min，離心6 min，棄上清，加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，加入500 μL結(jié)合緩沖液，充分混勻，加入5 μL 膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)，充分混勻，加入5 μL碘化丙啶(PI)，充分混勻，于1 h內(nèi)置于FACS Calibur流式細(xì)胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.3.7 SOD、GSH-Px活性與MDA含量檢測 收集各組NSCs培養(yǎng)上清液，按照檢測試劑盒分別檢測SOD、GSH-Px活性與MDA含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測MEG3與miR-455的靶向關(guān)系 經(jīng)LncBase網(wǎng)站預(yù)測LncRNA MEG3和miR-455存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建野生型載體WT-MEG3與突變型載體MUT-MEG3，取生長狀態(tài)良好的NSCs，將WT-MEG3、MUT-MEG3分別與miR-con、miR-455 mimics共轉(zhuǎn)染至NSCs，將其作為miR-con組及miR-455組，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，檢測各組相對熒光素酶活性。

1.3.9 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測CyclinD1、Bcl-2、p21、Bax、GFAP、β-tubulin-Ⅲ與PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組對數(shù)期NSCs，加入RIPA裂解液，冰浴30 min，4 ℃條件下經(jīng)1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液。采用BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白上樣量加入SDS上樣緩沖液，沸水中煮10 min。取蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封閉，加入一抗稀釋液，10×封閉-洗滌緩沖液(TBST)洗滌，4 ℃孵育24 h，TBST洗滌，孵育二抗稀釋液，室溫孵育1 h，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)及Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 MEG3和miR-455在MACO小鼠腦組織和缺氧NSCs損傷模型中的表達(dá)情況 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，MACO組小鼠腦組織中MEG3表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，miR-455表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。在缺氧NSCs損傷模型中，與對照組比較，模型組MEG3表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，miR-455表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。詳見圖1、圖2。

與假手術(shù)組比較，＊P<0.05。

與對照組比較，＊P<0.05。

2.2 抑制MEG3表達(dá)對缺氧NSCs損傷模型細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組MEG3表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞增殖活力明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，CyclinD1、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，p21、Bax蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；與Hypoxia+si-con組比較，Hypoxia+si-MEG3組MEG3表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，48 h、72 h細(xì)胞增殖活力明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，CyclinD1、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，p21、Bax蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。詳見圖3、圖4及表1。

圖3 抑制MEG3表達(dá)對缺氧NSCs損傷模型細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，＊P<0.05；與Hypoxia+si-con組比較，# P<0.05。

表1 各組MEG3表達(dá)、細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞凋亡率比較(±s)

2.3 抑制MEG3表達(dá)對缺氧NSCs損傷模型細(xì)胞分化和氧化應(yīng)激水平的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞中GFAP、β-tubulin-Ⅲ蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.05)，MDA活性明顯升高(P<0.05)；與Hypoxia+si-con組比較，Hypoxia+si-MEG3組細(xì)胞中GFAP、β-tubulin-Ⅲ蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05)。詳見圖5及表2、表3。

圖5 抑制MEG3表達(dá)對缺氧NSCs損傷模型GFAP和 β-tubulin-Ⅲ蛋白表達(dá)影響的條帶圖

表2 抑制MEG3表達(dá)對缺氧NSCs損傷模型GFAP和 β-tubulin-Ⅲ蛋白表達(dá)的影響(±s)

表3 抑制MEG3表達(dá)對缺氧NSCs損傷模型氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的影響(±s)

2.4 MEG3與miR-455的靶向關(guān)系 經(jīng)LncBase網(wǎng)站預(yù)測顯示MEG3和miR-455存在結(jié)合位點(diǎn)(見圖6)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型報(bào)告基因載體WT-MEG3的細(xì)胞中，與miR-con組(1.00±0.10)比較，miR-455組(0.38±0.07)熒光素酶活性明顯降低(t=15.238，P<0.05)；轉(zhuǎn)染突變型報(bào)告基因載體MUT-MEG3的細(xì)胞中，與miR-con組(1.02±0.12)比較，miR-455組(0.99±0.13)熒光素酶活性無明顯變化(t=0.509，P=0.618)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與si-con組(1.00±0.15)比較，si-MEG3組(3.17±0.21)細(xì)胞中miR-455的表達(dá)水平明顯升高(t=25.226，P<0.05)。

圖6 MEG3與miR-455的結(jié)合位點(diǎn)

2.5 MEG3通過靶向miR-455調(diào)控PI3K/Akt信號通路 Western Blot檢測結(jié)果顯示，與si-con組比較，si-MEG3組細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；與si-MEG3+anti-miR-con組比較，si-MEG3+anti-miR-455組細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，不同組間PI3K、Akt蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖7。

與si-con組比較，＊P<0.05；與si-MEG3+anti-miR-con組比較，#P<0.05。

2.6 抑制miR-455或PI3K/Akt信號通路能逆轉(zhuǎn)抑制MEG3對缺氧NSCs損傷模型的影響 與Hypoxia+si-MEG3組比較，Hypoxia+si-MEG3+anti-miR-455組、Hypoxia+si-MEG3+LY294002組48 h、72 h細(xì)胞增殖活力均明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，CyclinD1、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，p21、Bax蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，GFAP、β-tubulin-Ⅲ蛋白相對表達(dá)量及SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.05)，MDA含量明顯升高(P<0.05)。詳見圖8～圖10及表4、表5。

圖8 抑制miR-455或PI3K/Akt信號通路能逆轉(zhuǎn)抑制MEG3對缺氧NSCs損傷模型細(xì)胞凋亡的影響

與Hypoxia+si-MEG3組比較，＊P<0.05。

與Hypoxia+si-MEG3組比較，＊P<0.05。

表4 抑制miR-455或PI3K/Akt信號通路能逆轉(zhuǎn)抑制MEG3對缺氧NSCs損傷模型細(xì)胞增殖、凋亡的影響(±s)

表5 抑制miR-455或PI3K/Akt信號通路能逆轉(zhuǎn)抑制MEG3對缺氧NSCs損傷模型氧化應(yīng)激水平的影響(±s)

3 討 論

研究表明MEG3與糖尿病相關(guān)的微血管功能障礙有關(guān)[12]，而MEG3還通過靶向miR-21/PDCD4信號通路促進(jìn)缺血性神經(jīng)元死亡[13]，此外，沉默MEG3表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)生長并減輕大鼠腦缺血再灌注損傷[14]。本研究結(jié)果顯示，MCAO組MEG3表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，同時(shí)模型組細(xì)胞中MEG3表達(dá)水平明顯高于對照組，提示MEG3在缺氧誘導(dǎo)的NSCs損傷中發(fā)揮重要調(diào)控作用。有研究表明，CyclinD1可正向調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，p21可負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖[15]。Bcl-2、Bax蛋白參與細(xì)胞凋亡過程，Bcl-2是抗細(xì)胞凋亡蛋白，Bax是促細(xì)胞凋亡蛋白[16]。本研究結(jié)果提示，抑制MEG3表達(dá)可能通過上調(diào)CyclinD1、Bcl-2表達(dá)及下調(diào)p21、Bax表達(dá)，從而抑制缺氧誘導(dǎo)的NSCs凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。GFAP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，β-tubulin-Ⅲ標(biāo)記神經(jīng)元，通過測定不同組GFAP與β-tubulin-Ⅲ蛋白表達(dá)可反映NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元分化的水平[17]。本研究結(jié)果表明，抑制MEG3表達(dá)可促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的NSCs分化。氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡能力密切相關(guān)，自由基氧化能力增強(qiáng)可與體內(nèi)不飽和脂肪酸反應(yīng)生成MDA，從而促使細(xì)胞膜功能損傷最終引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，而SOD、GSH-Px屬于抗氧化酶類，其可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[18]。本研究結(jié)果提示，抑制MEG3表達(dá)可有效減輕NSCs氧化應(yīng)激損傷并增強(qiáng)其抗氧化能力。

肉桂酸通過促進(jìn)miR-455-3p表達(dá)及抑制HDAC2表達(dá)從而減輕小鼠顱腦損傷[19]。有研究表明，沉默LncRNA TTTY15表達(dá)可通過上調(diào)miR-455-5p表達(dá)從而減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[20]。相關(guān)報(bào)道指出，miR-455-5p表達(dá)下調(diào)可激活多種炎癥途徑進(jìn)而參與多發(fā)性硬化癥疾病發(fā)生過程[21]。miR-455-3p是從miR-455前體的3′端臂加工而來，miR-455-5p從miR-455前體的5′端臂加工而來，但關(guān)于miR-455在NSCs缺氧損傷過程中的作用機(jī)制尚未可知。本研究結(jié)果顯示，MCAO組、模型組miR-455表達(dá)水平明顯降低，進(jìn)一步研究顯示MEG3可靶向結(jié)合miR-455并負(fù)向調(diào)控miR-455表達(dá)，抑制MEG3表達(dá)可明顯上調(diào)miR-455表達(dá)，提示抑制MEG3表達(dá)可能通過上調(diào)miR-455從而減輕缺氧NSCs損傷。有研究表明，MEG3通過抑制PI3k/Akt信號通路從而促進(jìn)蛛網(wǎng)膜下隙出血所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷[22]。相關(guān)報(bào)道指出PI3k/Akt信號通路激活可促進(jìn)缺氧條件下NSCs增殖[23]。本研究結(jié)果顯示，抑制MEG3表達(dá)可通過上調(diào)miR-455表達(dá)而激活PI3K/Akt信號通路。為驗(yàn)證MEG3是否通過調(diào)控miR-455與PI3K/Akt信號通路而參與NSCs增殖、分化及氧化應(yīng)激過程，本研究對miR-455表達(dá)或PI3K/Akt信號通路進(jìn)行抑制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖活力降低，細(xì)胞凋亡率升高，表明抑制miR-455或PI3K/Akt信號通路能逆轉(zhuǎn)抑制MEG3對缺氧損傷NSCs的影響，提示抑制MEG3表達(dá)可能通過上調(diào)miR-455表達(dá)及激活PI3K/Akt信號通路對NSCs發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，MEG3表達(dá)量升高可加重NSCs缺氧損傷，其作用機(jī)制可能與抑制miR-455表達(dá)及PI3K/Akt信號通路活化有關(guān)，抑制MEG3表達(dá)可抑制缺氧誘導(dǎo)的NSCs凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，可為臨床治療提供新方向。但腦梗死等缺氧缺血性腦血管疾病的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。