三七-白芍配伍治療高血壓作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

雍蘇南，龍遠雄，藺曉源

高血壓是臨床常見的慢性病和多發(fā)病，血壓水平與心血管風(fēng)險呈連續(xù)、獨立、直接的正相關(guān)，將導(dǎo)致腦卒中、冠心病、終末期腎病等，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。我國第6次(2012年—2015年)高血壓抽樣調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，18歲及以上居民高血壓患病率粗率為27.9%，標(biāo)化率為23.2%[2]。全球現(xiàn)有高血壓病人超過10億人，預(yù)計到2025年，高血壓人群可能突破15億人[3]。西藥治療高血壓雖然降壓效果確切，但是多以單純控制血壓為主，長期使用存在依賴性大、副作用多且經(jīng)濟負擔(dān)重等諸多弊端，而中醫(yī)藥在高血壓的防治方面，具有多靶點、多途徑、毒副作用小等獨特優(yōu)勢。

本課題組前期研究證實，運用具有養(yǎng)陰柔肝、化瘀通絡(luò)功效的復(fù)方七芍降壓片治療高血壓臨床療效確切[4-6]，其中三七、白芍為該方的君藥，對于復(fù)方七芍降壓片發(fā)揮臨床療效起到至關(guān)重要的作用。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過生物信息學(xué)分析構(gòu)建“化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，以期揭示三七、白芍治療高血壓的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，為高血壓的中醫(yī)藥臨床治療提供藥理研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 三七、白芍有效化合物及作用靶點獲取 本研究通過中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺檢索三七、白芍的化學(xué)成分，并以口服吸收利用度(OB)≥30%、藥物相似性(DL)≥0.18為篩選條件，提取各味中藥的主要活性化合物。

1.2 高血壓疾病靶點預(yù)測 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)通過化合物MOL_ID編號檢索其作用靶標(biāo)，并通過Uniport數(shù)據(jù)庫檢索各靶點對應(yīng)的基因名；基于GeneCards數(shù)據(jù)庫，以“hypertension”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)基因，并與藥物活性化合物靶點取交集，得到三七、白芍治療高血壓的相關(guān)作用靶點。

1.3 “有效化合物-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將三七、白芍活性化合物及其作用于高血壓的相關(guān)靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，并利用“Network Analyzer”功能對中藥化學(xué)成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)進行分析，根據(jù)化合物與靶點連接情況篩選出三七-白芍治療高血壓的關(guān)鍵化合物。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選 將交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，并限定研究物種為人類，得到三七、白芍作用于高血壓的PPI網(wǎng)絡(luò)。借助Cytoscape 3.7.1軟件中的“Network Analyzer”對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，選取自由度(degree)、介數(shù)(betweenness)和中心性(closeness)都大于平均值的靶點為關(guān)鍵靶點。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析 為進一步了解核心靶點基因功能和三七、白芍治療高血壓的主要作用通路，將藥物與疾病相關(guān)靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，選定物種為“homo sapiens”，設(shè)定閾值P<0.05進行GO功能富集和KEGG通路分析，并對富集分析結(jié)果用R語言編程軟件進行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 三七、白芍有效化合物及作用靶點提取結(jié)果 通過TCMSP分析平臺檢索三七、白芍的主要有效成分，并設(shè)置口服生物利用度(OB≥30%)、類藥性(DL≥0.18)，篩選出各藥物有效成分，再根據(jù)有效成分“MOL_ID”獲取各化合物的靶點(以蛋白名表示)。其中篩選三七有效化合物8個，白芍有效化合物13個，三七與白芍重復(fù)化合物1個：MOL000358(beta-sitosterol)，去重后有效化合物20個，逐一對應(yīng)靶點時發(fā)現(xiàn)3個化合物找不到靶點，即三七-白芍藥對有效化合物17個(三七7個，白芍11個，重復(fù)1個)，得到有效化合物靶點461個，去重后剩余靶點數(shù)為138個，再通過Uniprot獲取各靶點基因名。詳見表1。

表1 三七-白芍有效化合物基本信息表

(續(xù)表)

2.2 高血壓疾病靶點預(yù)測 以“hypertension”為關(guān)鍵詞，利用GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索，得到與高血壓相關(guān)的靶點7 811個，按“Relevance score”排序提取Relevance score≥5的靶點，共1 324個靶點作為高血壓疾病相關(guān)的靶點，Relevance score 排名前50個的靶點詳見表2。

表2 高血壓疾病靶點(Relevance score排名前50個)

2.3 活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 三七-白芍去重后的有效化合物共20個(實際為17個化合物，其中有3個找不到靶點信息)，對應(yīng)去重后的靶點數(shù)為138個，通過與GeneCards數(shù)據(jù)庫中與高血壓相關(guān)的靶點基因(1 324個)進行比對，其中有62個可能是與治療高血壓相關(guān)的作用靶點(交集靶點)。詳見表3。

表3 三七-白芍治療高血壓相關(guān)的作用靶點

構(gòu)建中藥化學(xué)成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.7.1軟件中的“Network Analyzer”功能對中藥化學(xué)成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)進行分析，“節(jié)點”(node)代表三七-白芍所含藥物化學(xué)成分與潛在作用靶點；“邊”展現(xiàn)了中藥成分和其作用靶點之間的聯(lián)系，根據(jù)化合物與靶點連接情況篩選出三七-白芍作用于高血壓的關(guān)鍵化合物。

將138個化合物靶點與1 324個高血壓靶點基因取交集，得到62個交集基因，對應(yīng)三七-白芍中16個候選化合物(白芍-MOL001924無交集靶點，故未進入分析)，其中對應(yīng)三七化合物7個，白芍化合物10個，重復(fù)1個。借助軟件Cytocsape 3.7.1構(gòu)建中藥化合物-靶點基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中有78個節(jié)點(化合物節(jié)點16個，靶基因節(jié)點62個)和168條邊，詳見圖1。圖中度值最高的化合物為quercetin，其次為kaempferol、beta-sitosterol、Stigmasterol、DFV、(+)-catechin、Mandenol，詳見表4，這些度值較高的化合物可能是三七-白芍發(fā)揮治療高血壓的關(guān)鍵化合物。

圖1 有效化合物-作用靶點圖

表4 三七-白芍治療與高血壓相關(guān)的關(guān)鍵化合物(自由度>5)

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選 利用STRING數(shù)據(jù)庫，對藥物-疾病交集靶點(62個)進行PPI分析，研究物種設(shè)定為“Homo Sapiens”，獲得三七-白芍用于高血壓的PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖2)，以TSV格式文件保存后，導(dǎo)入Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，選取自由度、介數(shù)和中心性都大于平均值的靶點為關(guān)鍵靶點。

圖2 交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

網(wǎng)絡(luò)中有61個靶點發(fā)生蛋白相互作用(有1個靶點COLQ未與其他蛋白發(fā)生相互作用，已在PPI圖中刪除)，894條邊代表了蛋白之間相互作用。網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點的平均自由度為14.66，平均介數(shù)為57.81，平均中心度數(shù)為0.522，自由度、介數(shù)、中心度數(shù)均超過平均值的靶點有12個，詳見表5。推測這些靶點可能是三七-白芍治療高血壓的關(guān)鍵靶點。

表5 三七-白芍治療高血壓關(guān)鍵基因基本信息表

2.5 GO功能與KEGG通路分析

2.5.1 GO功能分析結(jié)果 將藥物-疾病交集基因?qū)隓AVID6.8數(shù)據(jù)庫，輸入靶基因名稱列表，限定物種為“Homo Sapiens”，閾值設(shè)定為P<0.05，進行GO功能分析和KEGG通路富集分析。62個基因影響了89個生物學(xué)過程，其中生物進程(BP)59個，細胞組分(CC)過程12個，分子功能(MF)過程18個，選取各類過程中P值排名前10的功能信息，其中P值越大，表示富集顯著性最強(見表6)。用R軟件進行可視化展示形成柱狀圖3，圖中藍色越深表示富集程度越顯著，紅色越深表示富集程度越不顯著，柱狀長度表示富集的基因數(shù)量，長度越長，表示富集基因數(shù)越多，發(fā)揮的作用可能越大。

圖3 GO分析結(jié)果

表6 藥物-疾病交集基因GO分析結(jié)果

2.5.2 KEGG分析結(jié)果 62個交集基因得到(P<0.05)通路共80條，選擇富集顯著排名前15的進行分析。詳見圖4。

圖4 KEGG 分析結(jié)果

3 討 論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，基于TCMSP、GeneCards、Uniprot、STRING等公共數(shù)據(jù)庫以及Cytoscape等軟件，系統(tǒng)科學(xué)地探討了三七-白芍配伍治療高血壓病的作用機制。三七-白芍可能發(fā)揮抗高血壓治療作用的關(guān)鍵成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、食脂素、兒茶素、甘露醇。已有研究顯示，槲皮素主要是通過調(diào)控ROS間接影響磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路，從而抑制炎癥和凋亡的發(fā)生，最終減輕動脈粥樣硬化程度，延緩高血壓的發(fā)生[7]。張文通等[8]研究發(fā)現(xiàn)山柰酚-3-O-蕓香糖苷能降低血管平滑肌細胞(VSMC)活力，減少遷移相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的表達，山柰酚-3-O-蕓香糖苷可能通過抑制TGFBR1信號通路抑制VSMC的增殖和遷移，從而延緩斑塊形成，預(yù)防高血壓。β-谷甾醇和豆甾醇的藥理作用廣泛[9-10]，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)血脂、抑制腫瘤等藥理活性，而炎癥反應(yīng)能刺激血管內(nèi)皮，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，從而引起血壓升高。β-谷甾醇可能通過抗炎作用來有效控制血壓。兒茶素可有效預(yù)防心血管疾病，調(diào)節(jié)血脂水平、抗氧化損傷、抑制血栓形成和低密度脂蛋白的氧化，降低氧自由基，從而維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)，維持血壓正常[11]。

進一步進行GO功能和KEGG通路分析預(yù)測，結(jié)果顯示，三七-白芍配伍治療高血壓作用機制的生物過程為氧化還原過程(富集靶點數(shù)10個)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(富集靶點數(shù)6個)、腺苷酸酯活化腎上腺素能受體信號通路(富集靶點數(shù)5個)等；主要影響的細胞組分為質(zhì)膜的組成成分(富集靶點數(shù)12個)、細胞外間隙(富集靶點數(shù)12個)、胞漿(富集靶點數(shù)12個)等；主要影響的分子功能為血紅素結(jié)合(富集靶點數(shù)9個)、蛋白質(zhì)均聚活性(富集靶點數(shù)7個)、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性(富集靶點數(shù)6個)。與高血壓密切相關(guān)的通路為：腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、鈣信號通路、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號通路、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路、環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G(cGMP-PKG)信號通路、心肌細胞腎上腺素能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。而炎性因子參與高血壓內(nèi)皮損害過程，TNF-α可上調(diào)內(nèi)皮細胞Fas表達，作用于Caspase-8、Caspase-3，從而引起微血管內(nèi)皮細胞凋亡，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[12]。研究表明，抑制VEGF-VEGF受體(VEGFR)通路可明顯使血壓升高，可見VEGF在血壓的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，VEGF與VEGFR-2結(jié)合后，激活PI3K/AKT通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)，從而使一氧化氮(NO)表達增加[13]；另一方面，酪氨酸激酶c-Src被激活后，導(dǎo)致磷脂酶Cγ1活化、生成肌醇1，4，5-三磷酸酯、Ca2+釋放、激活eNOS、介導(dǎo)其下游產(chǎn)物前列環(huán)素生成[14]，從而調(diào)控血管的生成、管壁的通透性及其舒縮功能，調(diào)節(jié)血壓。因此，在生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞通過內(nèi)源性VEGF維持細胞穩(wěn)態(tài)，通過VEGF信號通路促進血管生成、保證內(nèi)皮功能的正常，這對穩(wěn)定血壓是至關(guān)重要的[15]。HIF-1與VEGF的相互作用是缺氧狀態(tài)下毛細血管形成的主要機制[16]，HIF是由α和β兩種不同亞基單位組成的異源二聚體蛋白，在機體正常狀態(tài)下，HIF-1α?xí)ㄟ^泛素化作用在細胞內(nèi)降解，當(dāng)組織缺氧時，HIF-1α則會在胞質(zhì)聚集，轉(zhuǎn)入胞核，HIF-α增強后激活VEGF的表達，同時HIF-1α可促進基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的增殖、黏附，還可通過多種途徑抑制線粒體氧化代謝，降低活性氧(ROS)水平，從而發(fā)揮抗細胞凋亡和保護血管內(nèi)皮的作用[17]。另外，鈣離子是參與人體各項生理活動的重要信使，儲存于細胞外或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器中，若細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、生長抑制和細胞凋亡，參與調(diào)控平滑肌收縮、增殖等過程，從而誘發(fā)心血管疾病[18]。王瑤函等[19]觀察了cAMP對高血壓鼠血管平滑肌細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)cAMP可以通過抑制氧化應(yīng)激的上下游信號通路抑制Giα蛋白的表達和細胞增殖，從而減輕高血壓狀態(tài)下氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的并發(fā)癥對機體和細胞的影響。同時，在sCG催化下，細胞內(nèi)cGMP水平迅速升高，進一步激活下游靶點PKG，而PKG可增加通道活性，有效舒張血管平滑肌、擴血管、降血壓[20]。

綜上所述，三七-白芍的降壓機制主要與抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、維持血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)、調(diào)控血管平滑肌舒縮功能等多個方面有關(guān)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科，基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，強調(diào)對某個節(jié)點的多靶點分析，充分利用網(wǎng)絡(luò)平衡的觀點來認識藥物對機體的作用，這種研究模式正符合中藥復(fù)方治療疾病的“整體觀”以及其“多基因、多靶點、多通路”的療效優(yōu)勢研究，具有重要的應(yīng)用價值[21]。本研究挖掘了三七-白芍藥對治療高血壓的諸多靶標(biāo)，但因為公共數(shù)據(jù)庫平臺及軟件的使用局限，個別有效化合物的作用靶點無法搜集全面，將在今后的研究中繼續(xù)完善和深入研究驗證。