堿性蛋白酶法制備鮮牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工藝研究

賈永紅 廉立偉 劉小濤 周潤(rùn)芝

摘 要：血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）能夠抑制血管緊張素酶催化血管緊張素I轉(zhuǎn)化成能強(qiáng)烈收縮血管的血管緊張素II，是降壓藥物開發(fā)的重要分子。本研究以鮮牛奶為原料開展堿性蛋白酶法制備鮮牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工藝研究。結(jié)果表明，在L25（54）的正交實(shí)驗(yàn)中，在40 ℃、pH=11、酶和底物組成比例為1∶30的條件下，水解300 min的效果最好，多肽水解度可達(dá)到（46.58±0.77）%，此時(shí)ACEI的活力為（50±0.44）%。本研究為提高牛奶高附加值產(chǎn)品開發(fā)和利用水平提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：牛奶;堿性蛋白酶;ACEI;工藝

高血壓是一種嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病，以血壓長(zhǎng)時(shí)間、持續(xù)性升高為典型特征。伴隨日常膳食中油脂類、固醇類成分增多，生活節(jié)奏加快和壓力加大以及生態(tài)環(huán)境的污染破環(huán)，近年來(lái)我國(guó)高血壓患者數(shù)量持續(xù)增多，已給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和護(hù)理負(fù)擔(dān)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)高血壓患者約3億，其死亡率約占總死亡人數(shù)的42.5%[1-3]。長(zhǎng)期以來(lái)，高血壓病臨床治療藥物的作用機(jī)制主要包括β受體阻滯劑、利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）、血管緊張素受體阻滯劑、鈣拮抗劑及α受體阻滯劑等，雖然降壓機(jī)制多樣，但長(zhǎng)期服用會(huì)產(chǎn)生耐藥性及一些副作用[4-6]。因此，當(dāng)前以非藥物形式如食療法來(lái)治療高血壓的探討日益增加[5]，特別是一些藥食同源的動(dòng)植物越來(lái)越受高血壓患者的青睞[7]。

牛奶是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、方便易得的日常飲品，其中富含酪蛋白。自從1979年Brantle V等[8]從牛乳酪蛋白酶解產(chǎn)物中獲得一個(gè)由7個(gè)氨基酸組成的短肽以來(lái)，牛奶粗蛋白，特別是酪蛋白已經(jīng)成為生物活性肽制備的主要原料之一。ACEI作為一種對(duì)高血壓治療有顯著效果的活性多肽，多年來(lái)是研究者關(guān)注的重點(diǎn)。例如Maruyama[9]從酪蛋白水解物中獲得一個(gè)ACEI，Nakamura[10]從酸奶中獲得兩個(gè)具有ACEI活性的三肽。

鑒于不同來(lái)源的鮮牛奶中蛋白質(zhì)種類和成分的差異，本項(xiàng)目以寧波本地公司生產(chǎn)的鮮牛奶為原料開展堿性蛋白酶水解牛奶粗蛋白制備ACEI混合肽的研究，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化多個(gè)酶解因素，確定了一條具有較高ACEI混合肽得率的酶解工藝。本項(xiàng)目的研究可為當(dāng)?shù)厝槠菲髽I(yè)開展鮮奶精深加工提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮牛奶（市售鮮奶），寧波本地奶業(yè)公司;堿性蛋白酶（索萊寶，1∶200 000），北京;甘氨酰甘氨酰酪氨酰精氨酸四肽標(biāo)準(zhǔn)品（Gly-Gly-Tyr-Arg）（Peptides International），美國(guó);馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）（Merck），美國(guó);ACE（Merck），美國(guó);亮氨酸（Leu）（Amresco），美國(guó);三氯乙酸、雙縮脲試劑、甲醛、硼酸、鹽酸、β-巰基乙醇、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥基甲烷、鄰苯三酚、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸鹽等，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鮮奶粗蛋白的提取及蛋白含量檢測(cè)

參考呂桂善等[11]的方法并稍做修改，取1 kg鮮牛奶于大燒杯中，將其置于磁力攪拌器上邊攪拌邊加熱至80 ℃左右，約30 min，然后4 000 r/min離心20 min，將其脫脂。用6 mol/L的鹽酸調(diào)脫脂鮮奶溶液pH到4.6，使蛋白沉淀。接著，4 000 r/min離心15 min去除上清液。再用蒸餾水洗滌粗蛋白沉淀，調(diào)節(jié)其pH為中性，再次離心去除上清液，將沉淀冷凍干燥，即為鮮牛奶粗蛋白。粗蛋白中蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)采用凱氏定氮法。

1.2.2 粗蛋白堿性蛋白酶水解物的制備與多肽水解率測(cè)定

參考白騰輝等方法并修改[12]。在50 mL蒸餾水中加入一定量的鮮牛奶粗蛋白（15 mg/mL），磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，根?jù)堿性蛋白酶標(biāo)示的pH值調(diào)節(jié)水解酸堿度，然后加入一定量的堿性蛋白酶，在一定溫度下的恒溫振蕩器內(nèi)水解，持續(xù)一段時(shí)間后，100 ℃水浴10 min滅酶活以停止酶解反應(yīng)，將酶解混合液冷卻至室溫備用。

參考魯偉等[13]的多肽濃度檢測(cè)法測(cè)定酶解物的肽水解率。取2.5 mL粗蛋白堿性蛋白酶水解物，加入2.5 mL10%（W/V）的三氯乙酸（TCA）水溶液，漩渦混合儀混合均勻后靜置10 min，然后以4 000 r/min離心15 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶中，并用5%的TCA定容至刻度，搖勻。之后，取6.0 mL上述溶液置于另一試管中，加入雙縮脲試劑4.0 mL（樣液∶雙縮脲試劑=3∶2，V/V），于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10 min，2 000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm下測(cè)定OD值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中多肽濃度C（mg/mL），進(jìn)而求得樣品中多肽含量。以不同濃度的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo)X（mg/mL），以在OD540為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 粗蛋白堿性蛋白酶水解工藝的正交實(shí)驗(yàn)

依據(jù)已有的研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置L25（54）的正交實(shí)驗(yàn)表，4因素5水平參數(shù)設(shè)計(jì)如下：溫度參數(shù)為37 ℃、38 ℃、39 ℃、40 ℃、41 ℃;pH值參數(shù)為8、9、10、11、12;酶和底物組成比例參數(shù)為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60;水解時(shí)間為60 min、120 min、180 min、240 min、300 min。依據(jù)Design Expert軟件設(shè)計(jì)水解組合方案，測(cè)定每個(gè)組合的多肽水解度。

1.2.4 堿性蛋白酶水解物的ACEI體外活性測(cè)定

根據(jù)CUSHMAN的方法[14]采用以HHL為底物的非連續(xù)分光光度法并稍加改動(dòng)。將250 μL HHL加入100 μL超純水或不同酶解條件組合方案所獲得的肽混合物后，37 ℃水浴預(yù)熱5 min，立即加入150 μL ACE保溫反應(yīng)90 min后立即加入250 μL 0.5 mol/L HCl終止反應(yīng)。空白對(duì)照組在加入ACE之前加入250 μL 0.5 mol/L HCl后75 ℃水浴5 min，加入ACE，再保溫5 min。反應(yīng)后加入3 mL乙酸乙酯萃取5 min，靜置5 min后移取乙酸乙酯層2 mL至干凈試管中，85 ℃水浴蒸除乙酸乙酯，用3 mL 1 mol/L的NaCl溶液溶解萃取出的馬尿酸，在228 nm波長(zhǎng)分別測(cè)定體系的吸光值，計(jì)算差值（△A=A90 min-A0 min）。以單位時(shí)間內(nèi)吸光值的變化表示ACE活力，抑制劑對(duì)ACE的抑制作用按下列公式計(jì)算：

式（1）中：Ac為加入超純水時(shí)吸光值在90 min內(nèi)的變化;Ai為加入抑制劑（實(shí)驗(yàn)樣品）時(shí)吸光值在90 min內(nèi)的變化。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2019處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）的形式表示。利用Design Expert軟件設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)方案，數(shù)據(jù)分析和作圖采用GraphPad Prism生物統(tǒng)計(jì)軟件，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 鮮牛奶粗蛋白的制備

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鮮牛奶粗蛋白的抽提率為2.9%，鮮牛奶粗蛋白中蛋白含量為91.6%。因此，鮮牛奶蛋白抽提率為2.65%。

2.2 粗蛋白的堿性蛋白酶解L25（54）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。R值分析表明，多肽水解度的影響因素主次順序?yàn)閜H>水解時(shí)間>溫度>酶和底物組成比例。依據(jù)k值變化發(fā)現(xiàn)，最佳的水解條件組合為：在40 ℃、pH=11、酶和底物組成比例為1∶30的條件下，水解300 min的效果最好，多肽水解度可達(dá)到（46.58±0.77）%。

2.3 鮮牛奶粗蛋白酶解物ACEI活性測(cè)定

ACEI的結(jié)果為（50±0.44）%。見(jiàn)表1。

3 討論

ACEI是生物活性肽研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，酪蛋白水解物是ACEI一個(gè)重要的制備來(lái)源，動(dòng)物試驗(yàn)及臨床研究均顯示其具有較好的降血壓作用。

本研究開展了堿性蛋白酶法水解鮮牛奶粗蛋白制備ACEI混合肽的實(shí)驗(yàn)，借助L25（54）正交設(shè)計(jì)方案最終確定了在溫度為40 ℃、pH=11、酶和底物濃度組合比例為1∶30、水解時(shí)間為300 min的條件下可獲得（46.58±0.77）%的多肽水解度，此時(shí)ACEI活性為（50±0.44）%。

不同蛋白酶的活性位點(diǎn)不同，同時(shí)活力大小也受多方面條件影響，因此牛奶粗蛋白多肽水解產(chǎn)物的成分、活性表現(xiàn)等方面差別也很大。例如張秋會(huì)等[15]用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白的最佳條件為pH=7.4、溫度為40 ℃、水解時(shí)間為180 min，酶與底物的比例為1 400∶1（U/g）;再有陳旭峰等[16]用胰蛋白酶對(duì)牛乳酪蛋白進(jìn)行水解，在pH為7.5、溫度為50 ℃、酶和底物比例為1∶25、水解時(shí)間為120 min的條件下，得到具有抗氧化性的酪蛋白水解物。這些結(jié)果說(shuō)明了酶解實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性。

另外，體外有ACEI活性的多肽有可能到體內(nèi)后失去活性，也有體外ACEI活性不高，而在體內(nèi)表現(xiàn)出明顯抗壓效果的多肽。因此，針對(duì)包括ACEI在內(nèi)的由鮮牛奶粗蛋白經(jīng)酶解制備而獲得的功能寡肽中，其體內(nèi)外活性大小、穩(wěn)定性等因素還需要做針對(duì)性的深入探討，這對(duì)乳品產(chǎn)業(yè)高附加值科技產(chǎn)品的開發(fā)都具有重要意義。

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