小分子肽LK-5對(duì)肝纖維化小鼠的防治效果初步研究

廖彭瑩 楊玉蓉 韋引金 宋采鮮 黃艷瑩 韋春鳳 陳海平 李錦清 林燕媚

【摘 要】 目的：探討小分子肽LK-5對(duì)CCl4致小鼠肝纖維化的防治效果。方法：將昆明小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、秋水仙堿組和小分子肽低（15 mg/Kg）、高劑量組（60 mg/Kg）。采用皮下注射25%CCl4-橄欖油誘導(dǎo)建立小鼠肝纖維化模型。連續(xù)8周后，采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肝臟組織病理學(xué)變化，采用試劑盒法檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）的水平及肝組織中丙二醛（MDA）、過氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和羥脯氨酸（Hyp）的含量。結(jié)果：與模型組相比，小分子肽可改善小鼠肝組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)病變，顯著降低CCl4致肝纖維化小鼠血清的AST、ALT水平和肝組織MDA、Hyp含量，肝組織GSH-Px和SOD含量均明顯升高。結(jié)論：小分子肽對(duì)CCl4所致肝纖維化小鼠具有改善作用，其機(jī)制可能與抗脂質(zhì)氧化和清除自由基有關(guān)，其是否通過肝內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）發(fā)揮作用仍有待進(jìn)一步研究。

【關(guān)鍵詞】 小分子肽;肝纖維化;CCl4;防治

【中圖分類號(hào)】R285.5?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）17-0038-04

Preliminary Studies on the Prevention and Treatment of the Peptide LK-5 on Carbon Tetrachloride Induced Hepatic Fibrosis in Mice

LIAO Pengying YANG Yurong WEI Yinjin SONG CaixianHUANG Yanying WEI Chunfeng CHEN Haiping LI Jinqing LIN Yanmei

Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China

Abstract：Objectives to investigate the protective effect of the peptide LK-5 on carbon tetrachloride induced hepatic fibrosis in mice. Methods The Kunming mice were randomly divided into normal group，model group，Colchicine group，low-and high-dose （15 and 60 mg/Kg） peptide groups. The mice were sc injected with 25%carbon tetrachloride （CCl4） to establish hepatic fibrosis model.Continuous 8w later，the liver histology of tissue pathology were determined by hematoxylin-eosin （HE） staining. The activities of the alaninetransarninase （ALT） and aspartate transferase （AST） of the serum and the activities of malondialdehyde （MDA），superoxide dismutase （SOD），glutathione peroxidase （GSH-Px） and hydroxyproline （Hyp） in liver tissue were investigated by related reagent kits. Results Compared with the model group，the pathological changes of liver histopathology wereimproved，the AST and ALT levels of the serum，the MDA and Hyp contents of the liver tissue were reduced，and the activities of GSH-Pxand SOD were increased significantly.Conclusions the peptide showed improvement effects on the hepatic fibrosis mice induced by CCl4，and the mechanism may be related with anti-lipoid peroxidation and clearing out free radicals. Whether the mechanism is related with the renin-angiotensin system （RAS） in liver remains to be further studied.

Keywords：Peptide; Hepatic Fibrosis; CCl4;Protective Effect

器官纖維化是是指由于炎癥刺激導(dǎo)致器官實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死，細(xì)胞外基質(zhì)異常增多及過度沉積的一種病理過程，若不及時(shí)治療會(huì)發(fā)展為器官硬化甚至器官衰竭[1]，肝纖維化是其中一種，是多種慢性肝病共同的病理變化，是肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段[2]。我國肝病發(fā)病率高、影響面廣，約1.2億人攜帶乙肝病毒，約1/4病人會(huì)發(fā)展成慢性肝病，包括肝纖維化[3]。

RAS系統(tǒng)是人體非常重要的內(nèi)分泌系統(tǒng)[4]，其主要功能是維持血壓穩(wěn)定，同時(shí)局部組織RAS系統(tǒng)會(huì)通過自分泌、旁分泌和胞分泌等路徑維持機(jī)體平衡，分泌過多會(huì)引起器官纖維化[5]。ACE（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶）為RAS系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，主要功能是切除血管緊張素I（Ang I）的羧基端二肽生成血管緊張素II（Ang II），Ang II的主要功能是介導(dǎo)血管收縮，引起血壓升高，同時(shí)Ang II可通過多種路徑誘導(dǎo)或促進(jìn)器官纖維化[6]。臨床使用的ACE抑制劑卡托普利、賴諾普利、依那普利等除了具備降血壓功能外，對(duì)局部組織RAS系統(tǒng)中ACE-AngII-AT1R/ACE2-Ang （l-7）-Mas軸的主要成分也能產(chǎn)生影響，從而抑制器官纖維化病變[7-9]。因此，以ACE為靶點(diǎn)篩選的活性物質(zhì)可能具有控制血壓、抑制器官纖維化病變等多重效應(yīng)。

鱉甲為鱉科動(dòng)物中華鱉（Pelodiscus sinensis Wiegmann）的背甲，有滋陰清熱、退熱除蒸、軟堅(jiān)散結(jié)的功效[10-11]。臨床中醫(yī)將單方炙鱉甲[12]及鱉甲復(fù)方[13-14]等用于治療慢性肝纖維化。肽類成分是鱉甲的主要活性物質(zhì)，已經(jīng)從鱉甲中分離鑒定出多個(gè)具有抗肝纖維化的活性肽類[15-20]。在前期研究中，本課題組從鱉甲中分離鑒定了具有ACE抑制作用的小分子肽LK-5，IC50值為75.6 μmol/L[21]，其能否發(fā)揮抗肝纖維化作用值得探討。本論文采用肝纖維化小鼠模型初步探討了該小分子肽的防治效果。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 昆明種小鼠體質(zhì)量（20±2）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

1.2 藥物與主要試劑 小分子肽LK-5（>99.0%）由上海吉爾生化有限公司合成，秋水仙堿購自西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，CCl4為分析純，購自天津市富宇精細(xì)化工有限責(zé)任公司，橄欖油購自重慶江源油橄欖開發(fā)有限公司。

1.3 主要儀器 BSA224S 型電子天平（ 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），CP100NX型離心機(jī)（株式會(huì)社日立制作所），Infinite M200 PRO型全波長多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN），微板恒溫震蕩器（上海滬析實(shí)業(yè)有限公司），電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），超純水儀（南京易達(dá)科技發(fā)展有限公司）

1.4 分組、造模與給藥 小鼠隨機(jī)分為小分子肽低、高劑量組、空白對(duì)照組、模型組、秋水仙堿組，除模型組15只外，其余各組均為12只。采用皮下注射25%CCl4橄欖油溶液造模，1 次/3 d，每次2 mL/Kg。同時(shí)，小分子肽低、高劑量組按15、60 mg/Kg皮下注射給藥，陽性對(duì)照組以秋水仙堿按0.4 mg/Kg灌胃給藥，1次/d。正常組和模型組均灌胃等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)8周。

1.5 取材 末次給藥后，小鼠斷食不斷水過夜，稱定小鼠質(zhì)量，摘取眼球取血。將血液于3000 rpm離心15 min后，收集上清液，-80 ℃保存待檢。肝左葉用20%福爾馬林固定，進(jìn)行HE染色。取適量肝右葉低溫制成10%肝勻漿，離心留上清液-80 ℃保存待檢。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 小鼠體質(zhì)量及行為學(xué)變化 每3天稱一次體重，記錄小鼠體質(zhì)量變化。記錄小鼠每天進(jìn)食量。觀察小鼠的飲食量、毛發(fā)光澤程度和精神狀態(tài)。

1.6.2 肝臟病理組織學(xué)檢查 用10%甲醛溶液固定肝組織，常規(guī)石蠟包埋，4～6 μm 切片，HE染色后光鏡下觀察。

1.6.3 指標(biāo)檢測 按照試劑盒說明檢測血清中ALT、AST、ALB水平及肝組織中總蛋白TP、MDA、SOD、GSH-Px和Hyp含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均用（x±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，LSD檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P< 0.01，P<0.001 表示差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般狀態(tài) 空白對(duì)照組小鼠體重增長，毛發(fā)光滑且致密，行動(dòng)敏捷，二便正常。模型組小鼠食欲下降，體重增長較正常組緩慢，且精神萎靡不振，易怒易斗，毛發(fā)色澤暗淡紊亂，大便較稀，腹部脹氣。秋水仙堿組體重增長較正常組緩慢。小分子肽低、高劑量組生長情況基本正常，體重增長介于正常組與模型組之間，毛發(fā)有光澤，行動(dòng)如常。實(shí)驗(yàn)過程有動(dòng)物死亡。

2.2 小鼠肝臟大體及病理學(xué)檢測 空白對(duì)照組小鼠肝臟質(zhì)地柔軟，表面光滑且邊緣銳利多呈紅褐色，模型組小鼠肝臟質(zhì)地較硬，表面油膩且外觀有明顯腫脹，顏色暗淡多呈土黃色，表面有顆粒結(jié)節(jié)狀突起。小分子肽低、高劑量組肝臟外觀接近正常組，表面鮮有顆粒結(jié)節(jié)狀突起。

空白對(duì)照組肝細(xì)胞索排列整齊有序，中央靜脈外肝細(xì)胞散發(fā)排列整齊，肝細(xì)胞無損傷，肝小葉結(jié)構(gòu)無缺失，無炎癥細(xì)胞浸潤。模型組肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞壞死且擁擠成團(tuán)，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，大量炎癥細(xì)胞浸潤，說明肝纖維化造模成功。秋水仙堿組肝細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞大多完整，肝小葉完整。小分子肽低劑量組偶爾可見肝小葉中央靜脈缺失，肝索排列較清晰完整。小分子肽高劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞清晰完整。秋水仙堿與小分子肽低、高劑量均對(duì)小鼠肝纖維化癥狀有改善效果。各組小鼠肝組織切片HE染色情況見圖1。

2.3 對(duì)血清指標(biāo)的影響 與空白對(duì)照組相比，模型組的AST和ALT水平均顯著升高，表明小鼠肝纖維化模型造模成功;與模型組相比，秋水仙堿和小分子肽低、高劑量組的AST和ALT水平均顯著降低（P< 0.05，P< 0.01，P< 0.001）。結(jié)果見表1。

2.4 對(duì)肝組織MDA、GSH-Px、SOD、Hyp的影響 與空白對(duì)照組相比，模型組的MDA與Hyp水平均不同程度升高，SOD與GSH-Px水平均顯著降低（P<0.05，P<0.01）;與模型組相比，秋水仙堿和小分子肽低、高劑量組的MDA和Hyp水平均降低，SOD與GSH-Px含量均顯著升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

3 討論

肝纖維化的主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)沉積，CCl4是廣泛使用的致小鼠肝纖維化的一種經(jīng)典造模試劑[22]。肝纖維化水平常用指標(biāo)以病理組織切片檢查和反映膠原代謝的指標(biāo)肝組織Hyp含量為主[23]。血清ALT、AST水平是反映肝功能的重要生化指標(biāo)。CCl4刺激誘發(fā)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，MDA、SOD和GSH-Px水平從不同角度反映機(jī)體抗氧化能力，三者常共同檢測[24]。

本實(shí)驗(yàn)以肝纖維化小鼠為模型，對(duì)小分子肽LK-5的抗肝纖維化作用進(jìn)行了初步研究。模型組小鼠肝臟外觀腫脹，血清ALT、AST水平及肝組織Hyp含量均顯著上升，說明肝功能受損，提示造模成功。給予小分子肽LK-5，邊造模邊給藥，結(jié)果表明小分子肽組小鼠的肝功能指標(biāo)得到改善，ALT、AST、Hyp、MDA含量降低，SOD、GSH-Px的含量均顯著上升，提示提高了機(jī)體的抗氧化水平，減輕肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激，改善了肝細(xì)胞所受破壞，對(duì)肝臟產(chǎn)生了一定的保護(hù)作用[25]。

近年來肝內(nèi)RAS系統(tǒng)與肝纖維化疾病的相互關(guān)系愈來愈受到重視，鱉甲煎口服液被證實(shí)對(duì)肝纖維化大鼠的ACE-AngII-AT1R/ACE2-Ang（l-7）-Mas軸產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，從而抑制肝纖維化病變[26]。本實(shí)驗(yàn)表明具有ACE抑制活性的小分子肽LK-5對(duì)肝纖維小鼠具有一定的保護(hù)作用，可能與抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、增強(qiáng)肝臟抗氧化能力有關(guān)，其是否與肝內(nèi)RAS系統(tǒng)相關(guān)有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2021-01-13 編輯：劉 斌）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金（81960698）;2017 年廣西中醫(yī)藥大學(xué)青年基金項(xiàng)目（2017QN011），中藥學(xué)一流學(xué)科（桂教科研[2018]12號(hào)）;廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)學(xué)科青年教師提升計(jì)劃（050170035）;廣西中醫(yī)藥大學(xué) 2020 年自治區(qū)級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（202010600087）。

作者簡介：廖彭瑩（1984-），女，漢族，博士，副教授，研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)、天然藥物化學(xué)。E-mail： gxlpy@163.com