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    湖北楓楊水煎液誘導(dǎo)CIA模型大鼠滑膜細(xì)胞凋亡機(jī)制研究

    2021-09-23 00:52陳明向陽
    關(guān)鍵詞:楓楊凋亡

    陳明 向陽

    【摘 要】 目的:探究楓楊誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠細(xì)胞凋亡的機(jī)制,為楓楊治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供科學(xué)依據(jù)。方法:雄性健康SD大鼠60只,隨機(jī)分為空白組、模型組、雷公藤多苷組、楓楊水煎液低、中、高劑量組,除空白組外,其余各組建立CIA模型。造模成功后,分別給予相應(yīng)治療,測(cè)量膝關(guān)節(jié)直徑,進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分,觀察滑膜切片,檢測(cè)血清炎癥因子水平和相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)。結(jié)果:①一般情況:與模型組比較,各用藥組體重明顯增加,膝關(guān)節(jié)直徑、關(guān)節(jié)炎指數(shù)均有所下降,其中楓楊高劑量組效果優(yōu)于雷公藤多苷組(P<0.05)。②滑膜組織病理形態(tài)觀察:HE染色結(jié)果顯示,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。楓楊治療組能夠顯著緩解膝關(guān)節(jié)腫脹程度,抑制足部的紅腫,HE染色鏡下表現(xiàn)及評(píng)分也有所改善(P<0.05)。③ 細(xì)胞因子和相關(guān)蛋白:與模型組相比,各治療組TGF-β、IL-4水平明顯升高,IL-17A、IFN-γ水平顯著降低(P<0.05);滑膜組織中,Bcl-xl蛋白的表達(dá)降低,Caspase-8表達(dá)增加(P<0.05)。對(duì)于TNFRII,則存在楓楊低劑量組降低,中、高劑量組明顯上調(diào)其表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論:楓楊水煎液可有效緩解CIA大鼠臨床癥狀及病理改變,降低血清炎性細(xì)胞因子、提升抗炎因子水平,上調(diào)滑膜促凋亡蛋白、下調(diào)凋亡抑制蛋白表達(dá),促進(jìn)CIA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡。

    【關(guān)鍵詞】 楓楊;膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎;滑膜細(xì)胞;凋亡

    【中圖分類號(hào)】R593.22?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517(2021)17-0023-07

    Mechanism of Hubei Fengyang Decoction Induced-Apoptosis of

    Synovial Cells in CIA Rats

    CHEN Ming1,2XIANG Yang1,2*

    1.Department of Medicine,Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,China;

    2.HubeiProvinceKey Laboratory of occurrence and intervention of RheumaticDiseases(Hubei University for Nationalities),Enshi 445000,China

    Abstract:ObjectiveTo observe the therapeutic efficacy of Fengyang on rheumatoid? arthritis and evaluate the effect of Fengyang to induce synovial fibroblast cell? apoptosis in collagen-induced arthritic (CIA) rats.Methods Sixty healthy male SD rats divided into CIA control control (CC) group,Triptery giumpoly glycoside(TG)-treating group,and three Fengyang-treating(FY) groups bred with low,medium and high dose of Fengyang decoction.After successful establishment of the model,the diameter of knee joint was measured,the score of arthritis was scored,the synovium section was observed,and the level of serum inflammatory factors and the expression of apoptosis-related proteins were detected. Results ①General conditions:Compared with the model group,the weight of rats in each medication group increased significantly,the diameter of knee joint and the arthritis index decreased,among which,the effect of the high dose group of FY was better than that of the TG group (P<0.05).②Pathological observation of synovial tissue:The results of HE staining showed that there was a large amount of inflammatory cell infiltration in the knee joints of rats in the model group. FY groups could significantly alleviate the swelling degre of knee joint,inhibit the swelling of foot,and decrease the score of HE staining microscopy (P<0.05).③ELISA results for cytokines and Western Blot test for apoptosis-associated protein:Compared with the model group,the levels of TGF-β and IL-4 were significantly increased and the levels of IL-17A and IFN-γ were significantly decreased in each treatment group (P<0.05).④Western Blot test for apoptosis-associated proteins: Compared with the CC group,the expression of TNFRII in medium-dose and high-dose FY groups was significantly increased(P<0.05);The expression of Caspase-8 protein in each drug group was significantly increased(P<0.05);The expression of Bcl-xl protein was decreased in all medication groups(P<0.05).Conclusion The efficacy of Fengyang in treatment of collagen-induced arthritic rats may partially obtained by inducing synovial fibroblast cell apoptosisand regulating the expression of cytokines IL-17A, TGF-β,IFN-γ,IL-4.

    Keywords:Pterocarya;Collageninducearthritis;Synovialcells;Apoptosis

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性自身免疫性疾病,以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥及關(guān)節(jié)的進(jìn)行性破壞為主要特征,以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn),常見關(guān)節(jié)處疼痛、腫脹,呈持續(xù)性、反復(fù)性發(fā)作[1-4]。若不及時(shí)治療,最終可引起關(guān)節(jié)畸形,喪失關(guān)節(jié)功能。RA的發(fā)病機(jī)制并不十分明確,滑膜細(xì)胞增殖與凋亡失衡是目前研究的重要方向。RA滑膜細(xì)胞的增殖與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成、侵蝕軟骨及骨組織損傷為主要病理特征,從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞、畸形及功能喪失[5]。有研究[6]發(fā)現(xiàn),RA患者滑膜細(xì)胞增生明顯,而細(xì)胞凋亡率顯著減少,卻并沒有因過度增生出現(xiàn)過多的細(xì)胞凋亡,提示滑膜細(xì)胞的凋亡障礙可能是導(dǎo)致滑膜增厚的原因之一。有研究[7-8]表明,湖北楓楊(Pterocarya Hupehensis Skan,PHS)通過影響線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞凋亡,本實(shí)驗(yàn)建立CIA模型大鼠,用湖北楓楊水煎液進(jìn)行干預(yù),進(jìn)一步探討楓楊對(duì)CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜凋亡的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠60只(200±20)g,購(gòu)于武漢劍悅生物科技有限公司,許可證號(hào)為SCXK(遼)2015-0001。

    1.2 藥材與試劑 湖北楓楊樹皮,采自湖北省恩施市清江河灘,經(jīng)袁林副教授鑒定,為胡桃科Juglandaceae楓楊屬Pterocary Kunth植物。甲醇、異丙醇、冰醋酸(武漢市中天化工有限責(zé)任公司);BCA試劑盒、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢科瑞生物技術(shù)有限公司);雷公藤多苷片(浙江得恩德制藥股份有限公司);牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑(美國(guó)Sigma公司);大鼠IL-4、IFN-γ、TGF-β、IL-17AELISA試劑盒(酶聯(lián)生物);β-Actin 抗體、HRP 羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司);Bcl-xl、Caspase-8(abcam公司);TNFRⅡ抗體(美國(guó)CST公司);RIPA裂解液、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(10-180kD)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、蛋白酶抑制劑(上海碧云天生物技術(shù)研究所)。

    1.3 設(shè)備和儀器 酶標(biāo)儀(Thermo公司);電泳儀電源(北京六一生物科技有限公司);包埋機(jī)(美國(guó)通用電氣醫(yī)療集團(tuán));石蠟切片機(jī)(Leica公司);化學(xué)發(fā)光成像分析儀(美國(guó)通用電氣醫(yī)療集團(tuán))。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 模型建立 60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機(jī)選取10只作為正常組,其余50只制作CIA模型。

    2.2 動(dòng)物分組 將造模成功的50只大鼠,隨機(jī)分為5組,分別為模型組、雷公藤多苷組、低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組10只,未造模的10只大鼠作為正常組。

    2.3 給藥方案 雷公藤多苷組大鼠予以6.25mg/(kg·d)的雷公藤多苷混懸液灌服,楓楊低、中、高劑量組分別給予2.0g/(kg·d)、4.0g/(kg·d)、8.0g/(kg·d) 的水煎液灌服,正常組、模型組灌服等體積的生理鹽水,每組大鼠每天灌胃1次,連續(xù)灌胃28 d。

    2.4 取材 灌胃28 d后,禁食禁水12 h,待麻醉成功,打開胸腔,用采血針于心尖搏動(dòng)處取血,用于ELISA法檢測(cè)血清TGF-β、IFN-γ、IL-17A及IL-4水平。充分暴露大鼠雙膝關(guān)節(jié)腔,髕骨處可見一層淡黃色光滑組織,即為滑膜組織,利用手術(shù)刀及手術(shù)鑷小心對(duì)其進(jìn)行剝離并分離。

    2.5 一般情況 每7天測(cè)量一次體重、膝關(guān)節(jié)直徑、并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分,用以評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)炎癥程度。關(guān)節(jié)炎評(píng)分按照以下標(biāo)準(zhǔn):0分:無紅腫;1分:小趾關(guān)節(jié)紅腫;2分:趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹;3分:踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4分:包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。

    2.6 HE染色 將組織從多聚甲醛固定液中取出,在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)刀將目的部位組織修平整,經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明,明膠浸蠟及石蠟樹脂等包埋成含有滑膜組織的石蠟塊。蠟?zāi)毯?,從包埋框中取出,并進(jìn)行修整。將修整好的蠟塊置于切片機(jī)上切片,切片漂浮于攤片機(jī)溫水上將組織攤平,用載玻片將組織撈起,放入烘箱中烤片。取出切片,置于自動(dòng)染色機(jī)脫蠟染色,再用中性樹膠封片。最后鏡下觀察,并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:組織無病理學(xué)改變,記作0分;輕微炎癥浸潤(rùn)記為1分;中度記為2分;重度,但無血管翳生成記3分;嚴(yán)重的炎癥浸潤(rùn),形成血管翳或軟骨、骨侵蝕,記4分。

    2.7 ELISA法 檢測(cè)血清細(xì)胞因子水平? 按照ELISA試劑盒方法檢測(cè)血清TGF-β、IFN-γ、IL-17A及IL-4水平。

    2.8 Western Blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 提取滑膜蛋白,用BCA法測(cè)定蛋白濃度,然后將各組蛋白煮沸,加入四分之一體積的蛋白上樣緩沖液(5×)。取適量的樣本,在凝膠中依次加入蛋白上樣緩沖液(1×),Maker,各組蛋白樣本,蛋白上樣緩沖液(1×)進(jìn)行電泳。再將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用3%濃度的BSA封閉1h,加入不同的一抗進(jìn)行孵育:TNFRⅡ(1∶1000),Caspase-8(1∶1200),Bcl-xl(1∶1000)。過夜之后取出,TBST溶液洗膜3次,每次10 min,放入二抗(1∶12000),孵育2 h,TBST溶液洗膜3次。最后進(jìn)行顯色,ImageJ軟件分析條帶的灰度值,以內(nèi)參β-acting作為對(duì)照,得到各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

    2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行處理,均以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)的形式表示,樣本均數(shù)用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05則差異有顯著性意義。

    3 結(jié)果

    3.1 各組大鼠一般情況 正常組大鼠精神狀態(tài)較好,體重明顯增加,皮毛順亮,飲食正常,足部皮膚無紅腫情況,活動(dòng)自如。模型組大鼠體重增長(zhǎng)較正常組緩慢,皮毛較為暗淡枯槁,活動(dòng)量明顯減少,足部皮膚發(fā)紅腫起,關(guān)節(jié)活動(dòng)受限。各治療組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度均有所降低,飲食量略有增加,體重逐漸增長(zhǎng),足部皮膚情況也有所改善。

    3.2 體重變化 與正常組比較,模型組大鼠體重增長(zhǎng)緩慢。用藥后,各治療組大鼠體重均有所增加,楓楊中、高劑量組和雷公藤多苷組體重增長(zhǎng)明顯(P<0.05),楓楊低劑量組在用藥2周后體重明顯增加(P<0.05)。如圖1所示。

    3.3 楓楊水煎液對(duì)CIA模型大鼠膝關(guān)節(jié)直徑的影響 模型組與正常組相比,關(guān)節(jié)直徑明顯增大(P<0.05),治療1周后,各用藥組與模型組比較,關(guān)節(jié)直徑有所減小(P<0.05),到第4周發(fā)現(xiàn),關(guān)節(jié)直徑明顯減?。≒<0.05)。與雷公藤多苷組相比,楓楊高劑量組對(duì)大鼠關(guān)節(jié)腫脹的改善更為顯著(P<0.05)。如圖2所示。

    3.4 楓楊水煎液對(duì)CIA模型大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 模型組與正常組比較,有顯著性差異(P<0.01),且模型組數(shù)據(jù)上升,提示造模成功。治療1周后,雷公藤多苷組和楓楊高劑量組與模型組比較,有顯著性差異(P<0.05),治療2周以后,各治療組與模型組相比,有顯著性差異(P<0.05)。且與雷公藤多苷組相比,楓楊高劑量組對(duì)關(guān)節(jié)炎指數(shù)的改善有顯著效果(P<0.05)。如圖3所示。

    3.5 楓楊水煎液對(duì)CIA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜的影響 與正常組比較,模型組大鼠滑膜病理評(píng)分明顯升高(P<0.05),與模型組比較,各用藥組病理評(píng)分明顯降低(P<0.05),與雷公藤多苷組相比,楓楊高劑量組改善病理方面更為顯著(P<0.05),如圖4所示。鏡下可見:正常組大鼠滑膜組織中無明顯病理變化,模型組出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),滑膜細(xì)胞增多,且呈現(xiàn)多層,達(dá)到5~6層甚至更多。各用藥組與模型組相比,滑膜增生,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所緩解,層數(shù)也有所減少,而楓楊高劑量組效果最為明顯,如圖5所示。

    3.6 楓楊水煎液對(duì)CIA大鼠血清炎性因子水平的影響 與正常組相比,模型組大鼠血清中 TGF-β、IL-4含量明顯降低(P<0.05),IFN-γ、IL-17A含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,各用藥組大鼠TGF-β、IL-4水平明顯提高(P<0.05),IFN-γ、IL-17A顯著降低(P<0.05);與雷公藤多苷組相比,低劑量組對(duì)TGF-β含量的升高和IFN-γ的降低更為明顯(P<0.05),高劑量組對(duì)IL-17A水平的降低和IL-4的升高更為明顯(P<0.05)。如圖6所示。

    3.7 楓楊水煎液對(duì)CIA模型大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與正常組相比,CIA大鼠TNFRⅡ、Bcl-xl的蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05),Caspase-8的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與模型組比較:雷公藤多苷組和楓楊低劑量組大鼠的TNFRⅡ表達(dá)明顯降低(P<0.05);楓楊中、高劑量組TNFRⅡ表達(dá)反而明顯升高(P<0.05);楓楊低、中、高劑量組Caspase-8蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05),且均顯著高于雷公藤多苷組(P<0.05);各用藥組Bcl-xl蛋白表達(dá)均降低,其中楓楊低劑量組差異有顯著性意義(P<0.05);楓楊低劑量組Bcl-xl表達(dá)水平顯著低于雷公藤多苷組(P<0.05)。如圖7所示。

    4 討論

    細(xì)胞凋亡有兩個(gè)途徑:內(nèi)源性途徑和外源性途徑[9]。線粒體是發(fā)生內(nèi)源性途徑的重要細(xì)胞器,而細(xì)胞表面死亡受體是介導(dǎo)含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-8(Cysteinyl aspartate specific proteinase-8,caspase-8)激活的外源性途徑[10]。外源性途徑中,死亡受體激活的起始Caspase是Caspase-8,Caspase-8可通過激活Caspase-3執(zhí)行凋亡。另外,還能夠切割細(xì)胞基質(zhì)中的B細(xì)胞淋巴瘤(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白家族成員Bid前體[11],形成截?cái)嗟腂id(tBid),tBid可進(jìn)入線粒體中,并促使Bax等蛋白產(chǎn)生寡聚反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C),同時(shí)使凋亡誘導(dǎo)因子AIF及其他相關(guān)凋亡信號(hào)從線粒體釋放,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。研究發(fā)現(xiàn)楓楊水煎液可使大鼠滑膜組織凋亡誘導(dǎo)蛋白Caspase-8表達(dá)增加,凋亡抑制蛋白Bcl-xl表達(dá)降低。結(jié)合前期研究結(jié)果,說明楓楊能夠通過上調(diào)Capase-8并作用于Caspase-3和B細(xì)胞淋巴瘤-xl(B-cell lymphoma-xl,Bcl-xl)蛋白,引起Cyt-C和其他凋亡信號(hào)的釋放增加,從而促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡。

    腫瘤壞死因子受體(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)在免疫系統(tǒng)及相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用,包括Ι型(TNFRΙ)和Ⅱ型(TNFRⅡ)。腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)可分別與TNFRΙ和TNFRⅡ結(jié)合,介導(dǎo)不同的生物學(xué)活性[13]。在正常生理情況下,TNF-TNFRs系統(tǒng)保持凋亡與增殖兩方面功能的平衡,病理?xiàng)l件下,介導(dǎo)兩條相反的信號(hào)通路,會(huì)破壞這種平衡,導(dǎo)致機(jī)體免疫環(huán)境與功能紊亂,引起滑膜組織增生與炎癥,發(fā)生疾病。體外分別培養(yǎng)RA患者與正常人的成纖維滑膜細(xì)胞[14],發(fā)現(xiàn)與健康人相比,RA患者的滑膜細(xì)胞增生是通過上調(diào)TNFRΙ,下調(diào)TNFRⅡ表達(dá),來激活TNFR相關(guān)因子,導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor-kappaB,NF-κB)進(jìn)一步活化,阻礙細(xì)胞的正常凋亡,造成滑膜細(xì)胞過度增殖,組織增生。Blüml研究[15]發(fā)現(xiàn),TNFRΙ是關(guān)節(jié)炎發(fā)生的主要原因,而同時(shí)存在的TNFRⅡ?qū)﹃P(guān)節(jié)炎有保護(hù)作用。TNFRⅡ胞內(nèi)不存在死亡結(jié)構(gòu)域[16],但是能夠募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TNF receeptor associated factor 2,TRAF2),激活絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)和NF-κB信號(hào)通路,發(fā)揮抗炎作用。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,楓楊干預(yù)CIA大鼠后,低劑量組下調(diào)TNFRII,與雷公藤多苷作用相似;而中、高劑量則對(duì)TNFRⅡ有上調(diào)作用,與雷公藤多苷完全相反。楓楊對(duì)TNFRII明顯的雙向調(diào)節(jié)現(xiàn)象的機(jī)制與意義尚不清楚,但值得進(jìn)一步研究??紤]到TNFRII對(duì)關(guān)節(jié)炎癥的保護(hù)作用,推測(cè)中、高劑量楓楊通過上調(diào)TNFRⅡ表達(dá),與TNFRΙ競(jìng)爭(zhēng)TRAF2,從而促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡,同時(shí)抑制NF-κB信號(hào)通路上的炎癥因子的釋放,參與抗炎通路中的炎癥反應(yīng)過程。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)選擇楓楊治療劑量具有重要參考價(jià)值。前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,湖北楓楊可通過調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá),影響線粒體凋亡途徑,從而誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞凋亡。本研究對(duì)前期實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了延伸,在動(dòng)物水平進(jìn)行研究,證實(shí)在湖北楓楊對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用,其機(jī)理可能是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白TNFRⅡ、Bcl-xl和Caspase-8的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

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    (收稿日期:2021-01-13 編輯:劉 斌)

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81260458;No.81360672)。

    作者簡(jiǎn)介:陳明(1993-),男,漢族,碩士研究生,研究方向?yàn)橹嗅t(yī)內(nèi)科學(xué)。E-mail:274115617@qq.com

    通信作者:向陽(1961-),男,土家族,博士,教授、碩士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)轱L(fēng)濕免疫性疾病。E-mail:xiangy1961@126.com

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