小麥 TaP5CS基因抗旱相關(guān)分子標記的開發(fā)

于 銘，魏 凡，常鵬舉，楊智全，武 軍，陳東升，張曉科

(1.西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院，陜西楊凌 712100； 2.寧夏農(nóng)林科學院農(nóng)作物研究所，寧夏銀川 750002)

小麥是我國最重要的糧食作物之一，其生產(chǎn)關(guān)系到國家糧食安全和社會穩(wěn)定[1]。干旱是降低小麥品質(zhì)與產(chǎn)量的重要因素，提升小麥的抗旱性是小麥育種迫切需要解決的問題，而抗旱相關(guān)基因分子標記的開發(fā)可以提高選育抗旱小麥品種的效率。

植物體內(nèi)積累各種有機或無機物質(zhì)，其中有機物質(zhì)包括脯氨酸、甜菜堿等，能夠提高細胞液濃度，降低滲透勢，提高細胞吸水或保水能力，稱為滲透調(diào)節(jié)作用[2]。脯氨酸的積累有助于增加滲透脅迫的耐受性[3]，是高等植物應對干旱脅迫的適應性機制。研究發(fā)現(xiàn)，高等植物中脯氨酸合成的途徑有兩條，一條是從谷氨酸開始合成，另一條是從鳥氨酸或精氨酸開始合成[4]；干旱等逆境脅迫下，谷氨酸途徑是植物合成脯氨酸的主要途徑[5]，在吡咯啉-5-羧酸合成酶P5CS的作用下，谷氨酸轉(zhuǎn)化為吡咯啉-5-羧酸，再經(jīng)過吡咯啉-5-羧酸還原酶的反應最終生成L-脯氨酸。脯氨酸代謝過程中有很多酶的參與，其中 P5CS是脯氨酸合成的限速酶，對脯氨酸合成的速度起著決定性的作用。P5CS基因最早在豇豆中被克隆[3]，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草中脯氨酸含量提高了數(shù)十倍，增強了煙草的抗旱性[5]。水稻OsP5CS1、OsP5CS2基因及菜豆PvP5CS1和PvP5CS2基因在各種非生物誘導后其表達量明顯上調(diào)[6]。過表達P5CS基因使脯氨酸含量增加，提高了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、水稻和小麥的脅迫耐受性[7]。小麥TaP5CS基因轉(zhuǎn)入到擬南芥，促進了脯氨酸的合成積累，說明TaP5CS基因有增強抗旱性的積極作用[8]。在干旱等逆境脅迫條件下，抗旱性較強的品種，其TaP5CS基因的表達量和脯氨酸積累量高于弱抗旱性品種[9]，推測兩個小麥品種間TaP5CS基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可能存在差異，可望開發(fā)TaP5CS基因抗旱相關(guān)的分子標記，為小麥分子標記輔助育種提供幫助。

本研究選用國內(nèi)不同生態(tài)地區(qū)的小麥品種(系)，在萌發(fā)期鑒定抗旱性，并分析干旱脅迫下葉片脯氨酸累積量與抗旱性關(guān)系，以及TaP5CS基因響應干旱的表達模式，通過兩組極端抗旱品種間TaP5CS基因序列比對和自然群體驗證，開發(fā)該基因抗旱相關(guān)分子標記，以期為抗旱小麥品種的選育與鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為全國不同地區(qū)的119個小麥品種(系)，其中，強抗旱性品種長6878、銅麥4號、滄麥6001、龍麥32、中梁24，中等抗旱性品種晉麥47，弱抗旱性品種西農(nóng)2208、鄭麥9023、云麥46，極弱抗旱性品種揚麥158，用于研究干旱脅迫下葉片脯氨酸積累量與其抗旱性關(guān)系；選取2個強抗旱性品種(泰山1號和碧螞4號)與2個弱抗旱性品種(中麥9號和蘭天23)，用于TaP5CS基因組序列差異分析；選取一套中國春缺體-四體系材料(N1A-T1B、N1B-T1D、N1D-T1A)，用于PCR擴增引物的染色體定位。

1.2 小麥品種(系)萌發(fā)期抗旱性的鑒定

按照GB/T 21127-2007“小麥抗旱性鑒定評價技術(shù)規(guī)范”[10]，測定119個小麥品種(系)的相對發(fā)芽率，鑒定其萌發(fā)期抗旱性。抗旱性分為五級，即：極強(highly resistant，HR)、強(resistant，R)、中等(moderately resistant，MR)、弱(susceptible，S)、極弱(highly susceptible，HS)。

1.3 干旱脅迫下小麥幼苗葉片中脯氨酸含量的測定

將強抗旱性品種(長6878、銅麥4號、滄麥6001、龍麥32、中梁24)、中等抗旱性品種(晉麥47)、弱抗旱性品種(西農(nóng)2208、鄭麥9023、云麥46)和極弱抗旱性品種(揚麥158)每個品種分為兩組，室溫下用蒸餾水培養(yǎng)3～5 d，挑選生長一致的發(fā)芽種子，用1/2霍格蘭氏營養(yǎng)液培養(yǎng)至兩葉一心期[11]時，一組繼續(xù)正常培養(yǎng)，作為對照；另一組用含-0.5 MPa PEG-6000的1/2霍格蘭氏營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，作為脅迫處理，每個處理3個重復，采用茚三酮比色法，測定脅迫120 h時小麥幼苗葉片中脯氨酸的含量[12]。

1.4 生物信息學分析

從Ensemble Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)獲取小麥基因組序列和基因組注釋信息，繪制TaP5CS基因結(jié)構(gòu)圖。從Wheat Exp(https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/)獲取干旱脅迫下小麥葉片中TaP5CS基因的表達量。

1.5 TaP5CS基因抗旱相關(guān)分子標記的開發(fā)

依據(jù)小麥TaP5CS基因組全長序列，設計嵌式引物，克隆3個同源基因組的全長序列。以萌發(fā)期強抗旱性小麥品種(泰山1號和碧螞4號)與弱抗旱性小麥品種(中麥9號和蘭天23)的基因組為DNA模板，分段擴增TaP5CS基因組全長。用DAMAN軟件進行序列比對，針對兩組極端抗旱性品種間的序列差異設計特異性引物(表1)，擴增涵蓋變異位點的序列，以此變異位點，分為TaP5CS-1A-a和TaP5CS-1A-b兩種等位變異類型，TaP5CS-1A-b含有PflmⅠ限制性內(nèi)切酶的作用位點，而TaP5CS-1A-a沒有PflmⅠ的作用位點(圖1)。

表1 本研究使用的引物信息Table 1 Primer information used in this study

以119個品種(系)的基因組DNA為模板，采用引物CAPS-1A-F和CAPS-1A-R進行擴增，擴增產(chǎn)物使用PflmⅠ進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng) 1.2%瓊脂糖凝膠電泳，顯影照相并統(tǒng)計基因組成；為了電泳條帶更加清晰，采用半巢式PCR方法，以上述第一次PCR產(chǎn)物為模板，用引物CAPS-1As-F和CAPS-1A-R擴增涵蓋變異位點的小片段序列，擴增產(chǎn)物進行PflmⅠ酶切，電泳檢測其基因組成。用SPSS進行不同小麥品種(系)等位變異類型與萌發(fā)期相對發(fā)芽率的差異 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥品種(系)萌發(fā)期抗旱性鑒定結(jié)果

按照“小麥抗旱性鑒定評價技術(shù)規(guī)范(GB/T21127-2007)”，鑒定119個小麥品種(系)萌發(fā)期的抗旱性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試小麥品種(系)的平均相對發(fā)芽率為52.9%，部分品種(系)間相對發(fā)芽率的差異達到極顯著水平；極強、強、中等、弱和極弱抗旱等級的品種所占比例分別為 2.5%、14.3%、42.9%、33.6%和6.7%。所選材料抗旱性分布范圍廣泛，適合進行分子標記開發(fā)研究。

表2 10個不同抗旱等級的小麥品種模擬干旱脅迫120 h后葉片中脯氨酸含量、萌發(fā)期抗旱性等級和相對發(fā)芽率Table 2 Proline content,drought resistance level and relative germination rate after simulated drought stress for 120 h of 10 wheat varieties with different drought resistance

2.2 干旱脅迫下葉片中脯氨酸積累量與抗旱性的相關(guān)性

從表2可以看出，與對照處理相比，10個小麥品種經(jīng)120 h的干旱脅迫后，葉片中脯氨酸含量均極顯著增加，說明干旱脅迫會使葉片中脯氨酸含量明顯積累。干旱脅迫120 h后，不同抗旱性品種葉片中脯氨酸的積累量存在明顯差異，其中5個強抗旱性品種葉片中脯氨酸含量達到700 μg·g-1以上，中等抗旱性品種晉麥47脯氨酸含量為623.67 μg·g-1，弱抗旱性品種和極弱抗旱性品種脯氨酸含量低于400 μg·g-1；同時，10個品種干旱脅迫120 h后葉片中脯氨酸積累量與相對發(fā)芽率呈極顯著正相關(guān)(R2= 0.98)(P< 0.01)，表明小麥葉片響應干旱的脯氨酸積累量與抗旱性密切相關(guān)。

2.3 干旱脅迫對 TaP5CS基因表達模式的影響

從表3可以看出，隨干旱脅迫時間的延長，TaP5CS3個同源基因的表達量均呈上升趨勢，干旱脅迫1 h時，TaP5CS-1B的表達量迅速增加，與干旱脅迫0 h相比，增加189.88%；干旱脅迫6 h時，TaP5CS-1A的表達量劇增，與干旱脅迫1 h相比，增加1 254.70%，而TaP5CS-1B和TaP5CS-1D的表達量分別增加了605.65%和 1 026.80%。TaP5CS-1A表達量的劇增，說明TaP5CS-1A對小麥長時間干旱脅迫產(chǎn)生了強烈反應。

表3 不同干旱時間下 TaP5CS 基因的表達量(FPKM)Table 3 Expression level of TaP5CS genes under different drought time

2.4 TaP5CS基因抗旱相關(guān)分子標記的開發(fā)與驗證

對TaP5CS基因進行分段克隆，分別獲得預期大小的目的片段；將4個小麥品種泰山1號、碧螞4號、中麥9號和蘭天23的PCR擴增產(chǎn)物分別測序并拼接后獲得各自的基因組全長序列，TaP5CS-1A大小分別為12 996、12 997、12 996和12 995 bp；TaP5CS-1B大小分別為9 559、 9 558、9 559和9 558 bp；TaP5CS-1D大小均為 9 821 bp。

對兩組抗旱性極端小麥品種的TaP5CS基因組全長序列進行比對發(fā)現(xiàn)，TaP5CS-1B和TaP5CS-1D不存在相對應變異序列；TaP5CS-1A在兩組品種間存在2個SNP位點，發(fā)生在基因第5、7內(nèi)含子區(qū)域。由于TaP5CS-1A第5內(nèi)含子565 bp處的堿基G突變成A時，可以被PflmⅠ酶切(圖1)，用引物CAPS-1A-F和CAPS-1A-R擴增涵蓋此SNP位點序列，用中國春缺體-四體系引物進行染色體定位(圖2)，結(jié)果在N1A-T1B和水中未擴增出條帶，說明該PCR引物定位在1A染色體上，并且條帶大小與預期一致。PCR擴增的產(chǎn)物使用PflmⅠ進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在強抗旱性品種中酶切產(chǎn)物為單一條帶，大小為1 894 bp(圖3A)，暫被命名為TaP5CS-1A-a等位變異類型；而在弱抗旱性品種中酶切產(chǎn)物為1 706 bp、188 bp兩條帶(1 894 bp的條帶酶切不完全)，被命名為TaP5CS-1A-b等位變異類型。

利用PCR擴增及酶切的方法，對119個小麥品種(系)進行TaP5CS-1A基因變異位點檢測，分析不同等位變異類型與萌發(fā)期相對發(fā)芽率之間的關(guān)系。在119個小麥品種(系)中，晉麥 79等61個品種(系)在酶切產(chǎn)物中只存在1 894 bp的特異條帶，為TaP5CS-1A-a等位變異；淮麥18等58個品種(系)在酶切產(chǎn)物中存在2個條帶，分別為1 706 bp和188 bp，為TaP5CS-1A-b等位變異。為了便于觀察電泳結(jié)果，又設計了一對引物CAPS-1As-F和CAPS-1A-R，采用半巢式PCR的方法，以上述第一次PCR產(chǎn)物為DNA模板，對第二次PCR擴增產(chǎn)物用PflmⅠ酶切，結(jié)果與第一次PCR產(chǎn)物酶切完全一致(圖3B)。TaP5CS-1A-a和TaP5CS-1A-b等位變異類型品種(系)的平均相對發(fā)芽率分別為60.7%和 44.6%，前者的平均相對發(fā)芽率極顯著高于后者(表4)?？购敌詷O強的3個品種(系)的等位變異類型均為TaP5CS-1A-a，抗旱性極弱的8個品種(系)的等位變異類型均為TaP5CS-1A-b；在17個強抗旱性品種(系)中，15個是TaP5CS-1A-a等位變異類型，在40個弱抗旱性品種(系)中，有30個是TaP5CS-1A-b等位變異類型；在51個中等抗旱性品種中，TaP5CS-1A-a等位變異類型占 64.7%，TaP5CS-1A-b等位變異類型占35.3%。由此可見，TaP5CS-1A-CAPS分子標記與小麥萌發(fā)期抗旱性存在緊密的相關(guān)性，開發(fā)的分子標記可進行小麥種質(zhì)資源抗旱性的鑒定篩選。

表4 TaP5CS-1A-a和 TaP5CS-1A-b等位變異類型的相對發(fā)芽率及抗旱性不同級別的品種數(shù)Table 4 Relative germination rate and number of wheat varieties with different drought resistance levels in TaP5CS-1A-a and TaP5CS-1A-ballelic variation groups

3 討 論

脯氨酸是植物在干旱等逆境脅迫下滲透調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)之一，小麥體內(nèi)脯氨酸大量積累可保護亞細胞結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的完整性，為小麥正常生長提供保障[3]?？购敌圆煌钠贩N在干旱脅迫后，TaP5CS基因表達量存在極顯著差異，且TaP5CS基因表達量增加，脯氨酸含量升高[9]，說明小麥品種(系)抗旱性與TaP5CS基因的表達量呈正相關(guān)。在干旱脅迫6 h時，TaP5CS-1A基因的表達量與脅迫1 h相比增加了12.5倍，推測TaP5CS-1A基因在脅迫下發(fā)揮關(guān)鍵作用。TaP5CS-1A在基因結(jié)構(gòu)上與TaP5CS-1B、TaP5CS-1D存在明顯差異，TaP5CS-1A基因含有較多內(nèi)含子區(qū)域，研究表明，內(nèi)含子可介導基因的表達[13]。胡蘿卜素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶八氫番茄紅素合酶(phytoene synthase,psy)基因的內(nèi)含子變異影響其表達，使小麥籽粒中的黃色素含量發(fā)生變化，由此開發(fā)了檢測不同等位變異類型的分子標記[14]。由此，推測內(nèi)含子調(diào)控TaP5CS-1A基因的表達，使脯氨酸含量升高來響應干旱脅迫。

小麥干旱脅迫后脯氨酸積累量與其相對發(fā)芽率呈正相關(guān)，高發(fā)芽率是小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的前提。本研究在兩組抗旱性極端小麥品種間擴增出TaP5CS基因組全長序列，與數(shù)據(jù)庫中提交的序列相似度較高。本研究將TaP5CS-1A基因在編碼區(qū)6 742～6 983 bp的序列測出，為后續(xù)的研究提供基礎。經(jīng)比對2個強抗旱性和2個弱抗旱性品種間的TaP5CS-1A基因組全長序列，發(fā)現(xiàn)存在2個SNP位點，在第5內(nèi)含子內(nèi)的SNP位點兩端設計擴增此SNP位點的特異性引物，由于引物3’端變異導致PCR擴增效率降低，甚至PCR過程啟動失敗，選擇引物3’末端堿基與TaP5CS-1B基因存在差異，且引物3’末端堿基為AG，不容易出現(xiàn)二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)[15]，因此，上游引物和下游引物均僅存一個堿基變異就實現(xiàn)特異性擴增。但是引物CAPS-1A-F和CAPS-1A-R擴增的PCR產(chǎn)物進行酶切檢測時，需要使用較大用量的限制性內(nèi)切酶，酶切后的兩條帶1 894 bp和 1 706 bp分離需要較高濃度瓊脂糖凝膠和較長電泳時間，酶切后188 bp的條帶不利于觀察，給檢測帶來諸多不便。因此，采用半巢式PCR方法，以第一次PCR產(chǎn)物為模板，用引物CAPS-1As-F和CAPS-1A-R擴增涵蓋變異位點的小片段序列，此時PCR產(chǎn)物酶切條帶均較小，使得未被酶切條帶624 bp與酶切條帶436 bp和188 bp容易分辨。

小麥TaP5CS-1A基因SNP位點存在2種等位變異TaP5CS-1A-a和TaP5CS-1A-b。經(jīng)119個萌發(fā)期抗旱性不同的小麥品種(系)驗證， 90.0%的萌發(fā)期抗旱性強及以上水平的品種為TaP5CS-1A-a等位變異類型，79.2%的抗旱性弱及以下水平的品種為TaP5CS-1A-b等位變異類型。又因為兩種等位變異類型品種(系)的萌發(fā)期平均相對發(fā)芽率存在極顯著差異(P<0.01)，說明TaP5CS-1A基因與小麥抗旱性相關(guān)，同時也進一步證明了內(nèi)含子序列的變異與萌發(fā)期抗旱表型相關(guān)。TaP5CS-1A-CAPS分子標記可為小麥品種抗旱性的檢測和鑒定提供輔助方法，但內(nèi)含子對TaP5CS-1A基因響應干旱的表達調(diào)控機理還需要進一步研究。由于脯氨酸代謝過程中有很多酶參與，加上響應干旱脅迫由多基因調(diào)控，所以在強抗旱性品種中存在2個TaP5CS-1A-b等位變異類型，在弱抗旱性品種中存在10個TaP5CS-1A-a等位變異類型?？傊←溈购敌詸C理十分復雜，單一基因功能標記不足以全面鑒定其抗旱性，開發(fā)多個抗旱相關(guān)基因的功能標記來綜合全面提高鑒定小麥抗旱性的效率，可加速抗旱小麥品種的選育工作。