一株豬源豕鏈球菌的分離鑒定

邵 季 王志成 張 欣 羊 揚(yáng)＊

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州225009；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物疾病檢測(cè)與技術(shù)服務(wù)中心，江蘇 揚(yáng)州225009）

作為革蘭氏陽(yáng)性菌，鏈球菌在自然界中的分布十分廣泛，有莢膜，多呈雙球或短鏈形，單球菌也時(shí)常被發(fā)現(xiàn)。鏈球菌科不僅包含鏈球菌屬，還包括乳球菌屬。根據(jù)蘭氏分類(lèi)法，鏈球菌屬被分成了20多種血清型，豬鏈球菌與豕鏈球菌都屬于鏈球菌屬，二者在生長(zhǎng)形態(tài)上非常相似，細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下均呈現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性球菌形態(tài)，其在血瓊脂平板上，呈現(xiàn)明顯的β溶血。然而，盡管生長(zhǎng)特型與形態(tài)相似，兩者的毒力與致病力之間存在較大差異。

豕鏈球菌可以發(fā)揮人源與豬源致病作用，能對(duì)公共衛(wèi)生安全造成一定影響，應(yīng)當(dāng)引起相關(guān)重視[1-4]。

2018年12月，揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物疾病檢測(cè)與技術(shù)服務(wù)中心對(duì)江蘇省東臺(tái)市溱東鎮(zhèn)送檢的一例咽喉水腫、腦膜出血的病死豬進(jìn)行檢測(cè)，采集咽喉扁桃體，分離出一種菌株，該菌株顯示出懷疑是豬鏈球菌的明顯β溶血現(xiàn)象。為進(jìn)一步確證該菌，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)分子生物學(xué)手段及生化試驗(yàn)手段，對(duì)所分離疑似豬鏈球菌菌株進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 病料的分離培養(yǎng)

于血瓊脂平板上，接種從送檢死豬病料上無(wú)菌采集的心、脾、淋巴、扁桃體等組織，37℃培養(yǎng)16至24 h，挑取β溶血明顯、表明光滑的菌落，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 生化試驗(yàn)

按照鏈球菌菌株的生化指標(biāo)進(jìn)行生化培養(yǎng)管鑒定，挑取純化后的菌落，將菌株接種至生化管，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果。

1.3 全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)分析

將分離菌純化培養(yǎng)，獲取單菌落，在生物安全柜中涂布到MALDI靶板上，使其自然干燥；干燥后滴加70%甲酸溶液1μL，使其自然干燥；最后加入基質(zhì)溶液1μL，使其干燥后，放入全自動(dòng)生物質(zhì)譜儀中，進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 16s rDNA鑒定

利用16s rDNA法對(duì)菌株進(jìn)行分型鑒定。單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)；取1mL菌液離心，pdw水洗滌，100μL滅菌超純水重懸；煮沸5分鐘后離心，將上清液用作隨后的PCR實(shí)驗(yàn)的模板。對(duì)菌株的16s rDNA通過(guò)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，由南京擎科生物科技有限公司對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序。在GenBank中進(jìn)行Blast分析，獲取本次測(cè)序的結(jié)果。

1.5 藥敏試驗(yàn)

在超凈臺(tái)中用接種環(huán)挑取純化培養(yǎng)后單菌落，平板劃線布滿(mǎn)整塊平板，分別貼上相應(yīng)藥敏紙片，并在37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

1.6 耐藥基因及毒力基因檢測(cè)

根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)序列及參考文獻(xiàn)報(bào)道，首先通過(guò)PCR方法，對(duì)相應(yīng)基因進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)合成共4對(duì)毒力基因引物。同時(shí)設(shè)計(jì)10對(duì)引物，對(duì)細(xì)菌相應(yīng)耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。耐藥基因含其中ESBLs類(lèi)3種，氨基糖胺類(lèi)3種，喹諾酮類(lèi)2種，頭孢類(lèi)2種；毒力基因含豕鏈球菌重要毒力因子紅疹毒素A、B、C及鏈球菌溶血素O相應(yīng)基因speA、speB、speC、slo。

1.7 小鼠攻毒試驗(yàn)

ICR小鼠分為4組，陰性對(duì)照組1只腹腔注射0.1mL生理鹽水，其余三組各3只，按不同劑量稀釋菌液每組腹腔注射0.1mL菌液（濃度分別為105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL），觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離

該分離物被革蘭氏染色，表現(xiàn)為具有清晰鏈排列的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。在血平板上形成針尖大小、透明的β溶血菌落。

2.2 生化試驗(yàn)

該菌能發(fā)酵葡萄糖、乳糖等，MAG、PYR反應(yīng)陽(yáng)性，DPP、PMG、TMZ、精氨酸為陰性。

2.3 細(xì)菌鑒定

細(xì)菌16srDNA序列經(jīng)PCR擴(kuò)增，切膠回收后送南京擎科公司測(cè)序。序列經(jīng)Genbank比對(duì)后，與數(shù)據(jù)庫(kù)中豕鏈球菌具有99%同源性，與豬鏈球菌2型同源性為92%。隨后對(duì)分離菌進(jìn)行全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)分析，經(jīng)鑒定為豕鏈球菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)

通過(guò)藥敏紙片法，對(duì)分離菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，該分離菌對(duì)氯霉素、慶大霉素等抗生素敏感，而對(duì)氨芐西林、頭孢他啶、氨曲南等耐藥，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 耐藥性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 耐藥基因及毒力基因擴(kuò)增

對(duì)分離菌株進(jìn)行耐藥基因擴(kuò)增，TEM基因檢出陽(yáng)性。對(duì)分離菌株4種毒力基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均為陰性。

2.6 小鼠攻毒試驗(yàn)

試驗(yàn)組小鼠在注射分離菌懸液后未出現(xiàn)明顯癥狀，與對(duì)照組在一周觀察時(shí)間內(nèi)無(wú)差異。

3 討論

本病例中，送檢病死豬呈咽喉水腫、腦膜出血，通過(guò)細(xì)菌學(xué)檢查、生化鑒定初步判定為鏈球菌感染。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展將鏈球菌屬分類(lèi)由21種增至89種，之前尚未被分離或分類(lèi)為鏈球菌的鏈球菌屬的新成員已被重命名和定位。為進(jìn)一步鑒定該分離菌種類(lèi)，本研究隨后對(duì)臨床分離菌株進(jìn)行分子學(xué)分析及質(zhì)譜分析。

通過(guò)16s rDNA方法及質(zhì)譜檢驗(yàn)，臨床分離和懷疑的鏈球菌菌株被鑒定為豕鏈球菌。 豕鏈球菌和豬鏈球菌的形態(tài)相似，盡管具有相似的生長(zhǎng)特性，但致病性差異很大。豬鏈球菌病不僅對(duì)生豬的生產(chǎn)造成巨大損害，而且對(duì)人也有致病作用，是一種嚴(yán)重的人畜共患細(xì)菌感染性疾病；而國(guó)際上，對(duì)豕鏈球菌毒力的研究主要集中于人與豬，國(guó)內(nèi)則報(bào)道了牛源感染病例。

通過(guò)藥敏紙法對(duì)分離出的細(xì)菌進(jìn)行耐藥性測(cè)試，結(jié)果表明，分離出的細(xì)菌對(duì)氯霉素、慶大霉素等抗生素敏感，但對(duì)氨芐西林、頭孢他啶和氨曲南具有耐藥性。對(duì)分離菌10種耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，ESBLs類(lèi)TEM基因?yàn)殛?yáng)性，與藥敏紙片結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

隨后對(duì)豕鏈球菌重要毒力因子紅疹毒素A、B、C及鏈球菌溶血素O基因speA、speB、speC、slo進(jìn)行檢測(cè)，4種毒力基因均未檢出。本菌可能通過(guò)其他毒力因子發(fā)揮人源致病作用。

本次研究的結(jié)果表明，盡管分離的鏈球菌對(duì)豬致病性較弱，但它可以存在于豬中，并有可能成為繼發(fā)感染的病原體，應(yīng)引起更多關(guān)注。豕鏈球菌對(duì)公共衛(wèi)生安全能造成一定影響，在生產(chǎn)過(guò)程中，應(yīng)注意工作人員的防護(hù)，避免交叉感染。