微藻原生質(zhì)體制備技術(shù)研究進(jìn)展

徐曉瑩 史文凱 姜作真 賀加貝 曹亞男 劉燕英

摘 要：總結(jié)概括了微藻原生質(zhì)體制備技術(shù)，并對原生質(zhì)體制備過程中的影響因素進(jìn)行了深入探討。在此基礎(chǔ)上，論述了原生質(zhì)體制備技術(shù)在微藻中的應(yīng)用研究進(jìn)展，展望了該技術(shù)的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：微藻;原生質(zhì)體制備;研究進(jìn)展

中圖分類號：S917

1 原生質(zhì)體概述

原生質(zhì)體是指細(xì)胞完全去除細(xì)胞壁后被細(xì)胞膜所包圍的、具活力的細(xì)胞。原生質(zhì)體擔(dān)負(fù)著細(xì)胞的所有生命活動，是細(xì)胞生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。在原生質(zhì)體基礎(chǔ)上可進(jìn)行一系列技術(shù)操作，主要包括原生質(zhì)體再生、原生質(zhì)體融合和轉(zhuǎn)基因等培育選育新類型的生物技術(shù)等。上述技術(shù)的關(guān)鍵是對細(xì)胞壁進(jìn)行消化，以形成大量有活力的原生質(zhì)體，并使原生質(zhì)體高效地再生細(xì)胞壁，恢復(fù)到正常細(xì)胞狀態(tài)。原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)簡單、發(fā)育同步性好、遺傳物質(zhì)易于進(jìn)入細(xì)胞、易于再生分化完整植株等特點[2]使原生質(zhì)體的研究越來越受到重視。另外，原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)與有關(guān)分子、細(xì)胞和遺傳等學(xué)科相互交叉滲透，為高等植物的分子水平和細(xì)胞水平遺傳操作提供理想的實驗體系。

2 微藻原生質(zhì)體制備技術(shù)

早在1892年，藻類原生質(zhì)體首次使用機(jī)械法被分離出來，但該機(jī)械法靠手工操作，難度大，只限于能廣泛發(fā)生質(zhì)壁分離的組織，對膠質(zhì)物含量較高的藻類分離效果不佳，原生質(zhì)體的得率低。后來研究者發(fā)現(xiàn)酶液能降解細(xì)胞壁[3]，開辟了酶法制備原生質(zhì)體的新途徑。酶具有很強(qiáng)的專一性，同時水解條件十分溫和，在細(xì)胞能夠承受的范圍之內(nèi)，對細(xì)胞傷害較小，原生質(zhì)體的產(chǎn)率較高，可以獲得大量有活力的原生質(zhì)體，從而為研究提供必要原生質(zhì)體材料[4]。

早期酶法制備原生質(zhì)體過程中的酶主要來源于生物體內(nèi)，如微生物來源的微藻解壁酶（瓊膠酶、褐藻酸酶、卡拉膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、紫菜聚糖酶[5-6]等）和動物來源的微藻解壁酶（褐藻酸酶[7]、鮑酶、海螺酶Ⅲ、石鱉酶和笠貝酶[8]）。目前，廣泛用于原生質(zhì)體制備的酶主要有纖維素酶[4]、半纖維素酶、果膠酶[4]、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、崩潰酶、離析酶等。

3 酶法制備原生質(zhì)體的影響因素

影響微藻原生質(zhì)體制備的因素有很多，如酶的種類、濃度、酶解時間、酶解液pH值、藻細(xì)胞生長時期等因素。根據(jù)不同藻類細(xì)胞壁成分的不同，原生質(zhì)體制備過程中需針對性地采用不同的水解酶。如藍(lán)藻的細(xì)胞壁含有黏肽，因而可用溶菌酶處理獲得藍(lán)藻細(xì)胞的原生質(zhì)體;綠藻的細(xì)胞壁主要成分為纖維素，因此可以用纖維素酶處理而獲得原生質(zhì)體[8-9];而紅球藻細(xì)胞壁中含有糖蛋白分子及少量纖維素或幾丁質(zhì)[10-11]，多糖降解酶去壁效果并不好[12]。

酶中往往含有對原生質(zhì)體有害的物質(zhì)，因此在去壁過程中，酶濃度并非越高越好，若酶濃度過大，細(xì)胞脫壁太徹底甚至對已脫壁的原生質(zhì)體產(chǎn)生破壞作用，則大大降低原生質(zhì)體的再生率。另外，實踐表明，控制合適的酶解時間對原生質(zhì)體的制備也至關(guān)重要，如果酶處理時間太短，所獲得的原生質(zhì)體量少而不能滿足實驗需要，但長時間的酶解又會破壞早期釋放的原生質(zhì)體膜，導(dǎo)致原生質(zhì)體破碎或再生率降低，從而影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量和細(xì)胞壁再生的能力[13]。

合適的酶解溫度及酶解液pH值是水解酶發(fā)揮作用的重要因素。酶解溫度直接影響酶促反應(yīng)的速度，有研究表明，酶處理一般在10～30 ℃下進(jìn)行90 min。不同水解酶的最適溫度也存在差異，如果膠酶的最適溫度為25 ℃，而纖維素酶和半纖維素酶的適宜溫度為30 ℃。酶解液pH值不僅影響酶的活力和底物的特性，改變?nèi)鼙谛Ч?，而且影響已脫壁原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。所以原生質(zhì)體制備的最適pH值與制備過程中所用酶的種類以及細(xì)胞壁的成分密切相關(guān)[14]。

原生質(zhì)體的制備效率受藻細(xì)胞不同生長時期的影響較大，對數(shù)期的藻細(xì)胞代謝活躍，生長速率高，群體細(xì)胞的化學(xué)組成、形態(tài)及生理特征比較一致，并且細(xì)胞壁較薄，因此，使用對數(shù)生長期的細(xì)胞制備原生質(zhì)體時產(chǎn)率最高[4]。

藻細(xì)胞密度也對酶解效果有一定的影響，通過對不同密度藻細(xì)胞進(jìn)行酶處理相同時間比較發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，原生質(zhì)體的制備率隨著細(xì)胞密度的增加而增加，原因可能是藻細(xì)胞密度高，相互之間接觸比較頻繁，更有利于酶混合液的消化作用[15]。

眾多研究表明，阻礙微藻原生質(zhì)體制備技術(shù)發(fā)展的主要障礙在于微藻細(xì)胞壁成分的多樣性和復(fù)雜性。各種微藻細(xì)胞壁的組成差異巨大，甚至不同藻種、不同生長環(huán)境微藻細(xì)胞壁組成不盡相同，使得各種微藻原生質(zhì)體的制備條件也各不相同。因此要結(jié)合微藻細(xì)胞壁成分，選取一種或多種酶組成的混合酶來高效降解細(xì)胞壁，同時酶解時要考慮多重酶解環(huán)境因素的共同影響，是解決這一問題的有效途徑。張莉等[16]從煙臺海濱水域分離出一株四爿藻屬（Tetraselmis sp.）的藻株，應(yīng)用響應(yīng)曲面設(shè)計方法研究了混合酶的比例、濃度、緩沖液pH值等多參數(shù)的綜合效應(yīng)，確定了該藻株原生質(zhì)體制備的最適條件，得到了81.5%的理論最高制備率，與試驗驗證的80.5%的制備率誤差為1.24%，該研究為優(yōu)化單細(xì)胞微藻原生質(zhì)體制備條件提供了通用性模式。

4 藻類原生質(zhì)體制備技術(shù)研究進(jìn)展

微藻的細(xì)胞操作始于20世紀(jì)50年代末期，F(xiàn)ushs成功分離得到一種絲狀藍(lán)藻——顫藻（Oscillatoria amoena）的原生質(zhì)體[2]。1976年Berliner等[9]分離得到鼓藻的原生質(zhì)體;1977年Berliner[17]成功制備小球藻（Chlorella Vulgaris）的原生質(zhì)體;1989年Davies等[18]制備得到絲狀藍(lán)藻（Ulothrix gigas）的原生質(zhì)體。隨后，其它種類微藻的原生質(zhì)體也相繼制備成功。其中絕大部分屬于綠藻門（如布朗葡萄藻、衣藻、小球藻、雨生紅球藻、亞心形扁藻等），除此之外，只有少數(shù)幾株藍(lán)藻門（螺旋藻、項圈藻等）和紅藻門（紫球藻等）的藻株原生質(zhì)體成功分離。表1列出了2000年以來部分微藻原生質(zhì)體的制備情況。

隨著越來越多的藻類原生質(zhì)體被成功分離，研究者對酶解去壁過程以及細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了詳細(xì)的研究。Yamada等[27]利用透射顯微技術(shù)和掃描顯微技術(shù)對橢圓小球藻（Chlorella ellipsoidea）細(xì)胞壁的酶解過程中細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，試圖解釋藻細(xì)胞能夠形成原生質(zhì)體以及闡述細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和細(xì)胞穩(wěn)定性之間的關(guān)系。Yamada等[28]的另一研究發(fā)現(xiàn)，小球藻的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)可以分為三種類型，分別為胞壁外有三層的外層結(jié)構(gòu)、胞壁外有一薄的單層結(jié)構(gòu)和胞壁外沒有外層結(jié)構(gòu)。經(jīng)酶解實驗表明，只有胞壁外有一薄的單層結(jié)構(gòu)類型細(xì)胞壁的小球藻株可以用酶解的方法直接形成原生質(zhì)體。

對于生活史中多種細(xì)胞形態(tài)交互變化的雨生紅球藻，其細(xì)胞壁是由糖蛋白分子以及少量的纖維素和幾丁質(zhì)組成，所以Tjahjono等[29]提出以蛋白酶K來制備其原生質(zhì)體。隨后葉濤等[24]等用酸性緩沖液、EDTA和二硫蘇糖醇配制而成的預(yù)處理劑處理雨生紅球藻細(xì)胞，然后以纖維素酶、蝸牛酶和酸性緩沖液組成的復(fù)合高滲酶溶液來分離得到原生質(zhì)體，制備率可達(dá)68.3%。但是，在雨生紅球藻生活史中存在包括游動細(xì)胞和不動細(xì)胞等多種細(xì)胞類型[30-32]，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及組成均存在較大差異。游動細(xì)胞原生質(zhì)體外僅被透明、凝膠狀的胞外基質(zhì)所包被，而不動細(xì)胞形成了厚而致密的細(xì)胞壁[33]。Triki等[34]曾提出用蛋白酶K和纖維素酶分別處理雨生紅球藻游動細(xì)胞和不動細(xì)胞，但并沒有詳細(xì)分析二者的區(qū)別。以往這些原生質(zhì)體制備的研究中并未針對雨生紅球藻生活史中特定細(xì)胞，且需要進(jìn)行破壁預(yù)處理，方法繁瑣，耗時較長，所需酶種類較多，這些問題使雨生紅球藻原生質(zhì)體后續(xù)的遺傳等操作受到了極大的限制。直到2017年，Cheng等[35]首次將雨生紅球藻生活史中游動細(xì)胞和不動細(xì)胞均應(yīng)用于原生質(zhì)體制備，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白酶K對于兩種細(xì)胞原生質(zhì)體的釋放均有效，其中游動細(xì)胞經(jīng)蛋白酶K處理后可獲得90%的原生質(zhì)體釋放效率;而不動細(xì)胞酶解過程中同時添加了纖維素酶和蝸牛酶來促進(jìn)纖維素細(xì)胞壁的降解，但因次生細(xì)胞壁難以降解，原生質(zhì)體釋放效率僅為40%。該研究首次報道了酶解液中添加Ca2+能有效提高雨生紅球藻游動細(xì)胞的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高原生質(zhì)體制備效率。

5 總結(jié)與展望

由于微藻復(fù)雜多樣的細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)，微藻原生質(zhì)體制備的相關(guān)技術(shù)發(fā)展較為緩慢，其應(yīng)用仍處于發(fā)展階段。微藻原生質(zhì)體的成功制備為其細(xì)胞和分子水平的操作提供了良好的實驗操作體系，將帶動由原生質(zhì)體出發(fā)而進(jìn)行的有關(guān)微藻生理、生化、遺傳學(xué)等多種實驗技術(shù)的發(fā)展，對微藻養(yǎng)殖、遺傳育種以及高附加值產(chǎn)物的生產(chǎn)都有重要的意義。

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Abstract：The development of microalgae protoplast preparation technology was summarized and the influencing factors during the preparation process was discussed.Moreover，the research progress of protoplast preparation technology in microalgae was also discussed.

Key words：microalgae;protoplast preparation;research progress

（收稿日期：2021-07-15）