背角無齒蚌鈣調蛋白基因的克隆及Ca2+和Cd2+對其表達的影響

張明霞，張科，袁鳳娟，邱淵皓，馮文坡，邵向陽，蘇聰穎，李媛，董艷美，王夢琪，齊金旭，夏西超

平頂山學院醫(yī)學院，平頂山476000

地球表面水污染已經成為共同關注問題，為了系統而又全面反映水污染狀況，片腳類動物、多毛類動物、軟體動物、甲殼動物和魚類等一系列水生生物被推薦用于檢測水污染的指示生物[1]。指示生物涵蓋了多個生物類群，但是許多生物遷移頻繁和迅速，很難有效反映區(qū)域性水污染的狀況[2]。雙殼類動物屬于河流、沼澤和湖泊的底棲類生物，靠濾食水體營養(yǎng)物質和浮游生物來生活，成體形成后不會長距離遷移并在一個區(qū)域經過多年完成生長、成熟和繁殖[3]。與其他水生生物相比，雙殼類動物對水體中污染物檢測更具有代表性[4]。背角無齒蚌(Anodontawoodiana)廣泛分布于世界各地的淡水環(huán)境，在持久性有機污染物、殺蟲劑和重金屬等水環(huán)境污染檢測中常用作指示性生物；同時在水體凈化、顆粒物過濾、營養(yǎng)釋放和沉積物混合等方面也發(fā)揮著積極作用[5-6]。隨著水體污染的加劇，背角無齒蚌數量顯著減少，已在北美地區(qū)被列入瀕危生物。

水體重金屬污染一直以來是國際上關注的焦點，不僅給人類健康帶來嚴重的威脅，而且可以顯著干擾食物鏈的聯動效應，導致水生生態(tài)系統遭到破壞。鎘(Cd)是許多生物體的非必需金屬元素，隨著人類活動的加劇，大量的Cd隨降雨進入河流、湖泊和海洋等水環(huán)境中[7]。長期慢性的Cd暴露能影響神經系統、呼吸系統和消化系統的功能，導致組織臟器損傷。Cd具有較強的生物蓄積性，在體內半衰期較長[7]。海洋、河流和湖泊等水體及其沉積物中的Cd可通過食物鏈傳遞作用而逐漸富集于水生生物體內[7-8]。目前，Cd已經成為環(huán)境中最常見的7種重金屬元素之一，已給水生生物的生存、發(fā)育和繁殖等帶來嚴重的威脅，探討和揭示Cd對水生生物毒性機制已成為研究熱點[8]。

鈣調蛋白(CaM)是Ca2+結合蛋白，是一種廣泛存在且高度保守的真核生物蛋白，可參與細胞程序性死亡、自噬、肌肉收縮、炎癥和免疫應答等多種生理活動中[9]。CaM與Ca2+結合后可以形成復合物，進一步與CaM的結合蛋白結合，可以直接調控靶基因的活性[9]。在整個調控過程中，CaM參與蛋白質翻譯、蛋白質磷酸化、細胞周期和環(huán)核苷酸代謝等細胞生物學過程[10]。研究顯示，Cd2+與Ca2+的離子半徑接近，也可以結合CaM，進而影響下游效應蛋白的功能[11]；大鼠仔鼠成骨細胞體外研究表明，Cd2+處理可以顯著增加細胞內Cd2+水平，激活CaM并最終誘發(fā)細胞凋亡；Cd2+暴露能夠激活CAMKⅡ通路，導致培養(yǎng)系膜細胞和神經細胞死亡[12-13]；以上研究結果提示CaM是Cd2+在機體內作用的潛在靶點。Cd2+在水生脊椎動物中毒理學研究已多有報道，但對水生無脊椎動物研究較少。由此，本研究選擇背角無齒蚌作為研究對象，克隆背角無齒蚌CaM全基因序列，比較Ca2+和Cd2+暴露后對該基因時空表達的影響，從而為探討Cd2+對水生生物的毒理學機制提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

背角無齒蚌購自南陽市水產市場，CaCl2(≥99.9%)和CdCl2(≥99.99%)購自阿拉丁公司，CaCl2和CdCl2溶解于去離子水中以制備儲備液。TRIzol試劑、M-MLV反轉錄酶、菌株DH5α、克隆載體pMDl9-T、連接酶、PCR產物回收純化試劑盒、RACE試劑盒均購自寶生物生物科技有限公司，其余常規(guī)藥品均為進口或國產分析純級。

背角無齒蚌殼長(6.5±0.5) cm，動物置于實驗室自動水循環(huán)系統中適應養(yǎng)殖2周，期間停止進食。隨后，動物處理實驗在長方體的塑料盒(長×寬×高：40 cm×25 cm×10 cm)中進行，每個盒子里面8只河蚌，飼養(yǎng)采用人工模擬池塘水(每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)，喂食小球藻(Chlorellavulgaris)。為了確定AwCaM1基因的組織分布，對來自同一塑料盒內5只動物進行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟、血淋巴和外套膜等組織。動物處理實驗過程中，動物分為對照組、Ca2+處理組(CaCl2，0.01、0.02、0.04、0.08和0.16 mg·L-1)和Cd2+處理組(CdCl2，1、2、4、8和16 mg·L-1)，Ca2+和Cd2+處理濃度選擇參考已有研究[14-15]，對照組用同體積去離子水處理。分別在0、6、12、24和48 h時每組中取出5只河蚌，解剖肝胰臟、鰓和外套膜，液氮速凍，于-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取與cDNA模板制備

按照試劑盒說明書的要求，使用TRIzol法(Takara，大連)提取總RNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。用M-MLV第一鏈cDNA合成試劑盒(Takara，大連)合成第一鏈cDNA，作為PCR擴增反應的模板。

1.3 AwCaM全基因序列的克隆

根據雙殼綱、腹足綱、昆蟲綱、甲殼綱和脊椎動物在內其他物種的CAM保守區(qū)域設計簡并引物CAM1和CAM2，用于擴增AwCaMcDNA片段，將PCR產物克隆到pMDT-19(Takara，大連)、采用雙向測序，鑒定為CAM部分序列。以部分cDNA序列中設計特異引物(表1)，根據RACE試劑盒說明書，采用巢式PCR方法擴增AwCaMcDNA的5’和3’區(qū)域。擴增產物克隆載體，雙向測序、序列比對和拼接。

1.4 序列與系統發(fā)育的分析

在GenBank數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中采用BLAST方法對AwCaM1序列進行了比對和分析；采用DANMEN軟件對AwCaM1基因進行多序列比對；采用信號肽預測數據庫(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)對AwCaM1信號肽序列進行預測；采用SMART數據庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)對AwCaM1蛋白質二級結構域進行預測；采用SWISS模型(http://swissmodel.expasy.org/)對AwCaM1的三維結構進行預測；用MEGA 5.0鄰位連接方法，構建AwCaM1系統進化樹。

1.5 虹吸行為測定

動物虹吸過濾行為處理在參考文獻[16]的基礎上稍作調整，在Ca2+和Cd2+暴露完畢后，對照組和各處理組取5只動物，置于100 mL中性紅溶液的燒杯中，靜止放置2 h，動物通過自身過濾行為予以換水。動物放入前和2 h虹吸過濾后，每個燒杯中取1 mL水樣，采用分光光度法測量530 nm處吸光值并予以記錄。用標準中性紅溶液構建標準曲線，采用以下公式計算動物虹吸行為中濾過率：

式中：M表示供試溶液的體積(mL)，n表示所用河蚌數量，t表示時間(h)，c0表示染料初始濃度(mg·L-1)，ct表示時間t時的濃度(mg·L-1)，m表示濾過率(%)。

1.6 real-time PCR定量檢測AwCaM1的表達

為了確定AwCaM1轉錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒并按照說明書的要求進行定量分析。根據已有貝類內參基因研究結果，選取β-actin作為內參基因[17-18]，根據內參基因和AwCaM1特異引物分別分離對應序列(表1)，瓊脂糖凝膠電泳僅檢測出一個擴增條帶，PCR產物回收、測序、鑒別；結合熔解曲線和擴增曲線結果確定內參基因和目的基因表達的特異性和高效性。使用ABI7500實時檢測系統(Applied Biosystems，美國)，采用兩步法進行real-time PCR，構建標準曲線，通過2-△△CT分析AwCaM1表達水平。

1.7 統計學處理

Ca2+和Cd2+處理后AwCaM1的表達水平的顯著性差異采用單向方差分析(analysis of variance, ANOVA)，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 背角無齒蚌AwCaM1的分子結構

背角無齒蚌AwCAM1 cDNA全長由692個堿基組成(GenBank，KY996397)，包含一個51 bp的5’非編碼區(qū)(UTR)、155 bp的3’UTR和516 bp開放閱讀框。開放閱讀框編碼172個氨基酸的多肽鏈，分子量為19.22 kDa，理論等電點為4.07(圖1)。3’UTR包含一個終止信號(AATAAA)和終止密碼子(TAG)。AwCaM1氨基酸序列包含有4個Ca2+結合EF-手形結構域，分別位于34～63 aa、71～99 aa、108～136 aa和144～172 aa(圖1)。

圖1 背角無齒蚌AwCAM1基因的cDNA序列和推導的氨基酸序列注：粗體標示起始和終止密碼；波浪線標示終止信號“AATAAA”；方框標示Ca2+結合EF-手形結構域。Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of AwCaM1 of Anodonta woodianaNote: The start and stop codons are indicated with bold; putative polyadenylation signal “AATAAA” is showed with wavy line; the four Ca2+-binding domains are marked with box.

AwCaM1與其他物種CaM序列具有高度保守性，人類CaM的2個關鍵磷酸化位點(Thr79和Ser81)在AwCaM1中存在(102 aa和104 aa)(圖2)；人類CaM序列中Arg75、Ile86和Tyr100這3個氨基酸殘基在AwCaM1中分別被Lys、Leu和Phe取代(圖2)。背角無齒蚌AwCaM1蛋白質二級結構包含7個α-螺旋和8個β-折疊(圖3(a))，該二級結構其他物種的CaM二級結構非常相似；AwCaM1三維結構與其他物種CaM具有高度相似性(圖3(b))。

圖2 背角無齒蚌AwCaM1與其他物種CAMs序列多重比對注：灰色陰影標示磷酸化位點Thr和Ser；方框標示Ca2+結合EF-手形結構域。Fig. 2 Multiple alignment of AwCaM1 of Anodonta woodiana with other CaMsNote: Two crucial phosphorylation sites of Thr and Ser are indicated with shadow; the four Ca2+-binding domains are marked with box.

圖3 背角無齒蚌AwCaM1二級和3D結構預測注：(a)AwCaM1二級結構；(b)AwCaM1的3D結構。Fig. 3 Predicted secondary and 3D structures of AwCaM1 deduced amino acids of Anodonta woodianaNote: (a) The secondary structure of AwCaM1; (b) The 3D structure of AwCaM1.

2.2 AwCaM1系統進化分析

BLAST分析表明，AwCaM1氨基酸序列與其他物種CaM有高度同源性。與海洋雙殼類合浦珠母貝(Pinctadafucata)同源性96%，與水蚤(Daphniamagna)同源性為94%，與黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)同源性為96%，與人(Homosapiens)同源性為95%。分子進化樹結果顯示，AwCaM1與淡水蚌類的進化關系最為密切。盡管淡水蚌和海水蚌同屬于雙殼綱，卻位于不同的進化組群(圖4)；CaM并未按照親緣關系進行排序，如：蜘蛛(Cupienniussalei)、仿刺參(Apostichopusjaponicas)和青島文昌魚(Branchiostomabelcheritsingtauense)劃分在一個組群，脊索動物玻璃海鞘(Cionaintestinalis)、駱駝(Camelusdromedaries)、人(Homosapiens)和鳥類紅腿鶴(Cariamacristata)劃分在同一個組群(圖4)。

圖4 根據背角無齒蚌AwCaM1氨基酸序列使用鄰接法構建的系統進化樹Fig. 4 Phylogenetic relationship of AwCaM1 of Anodonta woodiana according to neighborhood-joining method

2.3 AwCaM1的2個提前終止密碼子突變的分析

背角無齒蚌體內存在AwCaM2(GenBank KY996398)和AwCaM3(GenBank KY996399)2個提前出現終止密碼子的突變序列，AwCaM2和AwCaM3整個cDNA序列分別包括610 bp和546 bp核苷酸。AwCaM2和AwCaM3與AwCaM1在1～535之間具有相同的核苷酸序列組成(圖5)。與AwCaM1核苷酸序列相比，AwCaM2的3’UTR缺少AATAA信號，AwCaM3缺失終止密碼子和AATAA信號序列(圖5)。

2.4 AwCaM1組織分布

實時定量PCR結果顯示，背角無齒蚌AwCaM1在斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、外套膜、心臟中廣泛表達(圖5)。AwCaM1在外套膜和鰓中表達水平較高，肝胰臟、斧足和心臟中呈中等水平表達，閉殼肌和血淋巴中呈較低水平表達(圖6)。

圖5 背角無齒蚌AwCaM1、AwCaM2和AwCaM3核苷酸比對注：綠色方框標示終止密碼(TGA)；紅色下劃線標示終止信號“AATAAA”。Fig. 5 Alignment of nucleotide sequences of AwCaM1, AwCaM2 and AwCaM3 of Anodonta woodianaNote: Stop codons (TGA) are indicated with green box; putative polyadenylation signal “AATAAA” is showed with red underline.

圖6 Real-time PCR法分析背角無齒蚌AwCaM1 基因的空間表達注：每組數據來源于5只動物。Fig. 6 Real-time PCR analysis of AwCaM1 transcript from different tissues of Anodonta woodianaNote: n=5 replicates for each group.

2.5 Ca2+和Cd2+處理對背角無齒蚌虹吸行為的影響

虹吸行為結果表明，與對照組相比，濃度為0.01、0.02、0.04和0.08 mg·L-1的Ca2+處理組動物的濾過率無統計學意義差異(圖7)。與對照組相比，0.16 mg·L-1的Ca2+處理組動物的濾過速率顯著降低(P<0.05)(圖7)。不同濃度Cd2+處理可導致動物濾過率顯著降低(圖7)；與對照組相比，2、4、8和16 mg·L-1的Cd2+處理組動物濾過率分別減少31.37%(P<0.05)、56.04%(P<0.01)、64.35%(P<0.01)和87.38%(P<0.01)(圖7)。

圖7 Ca2+和Cd2+處理對背角無齒蚌虹吸行為的影響注：每組每個時間點n=5；*、#表示與同一時間點對照組相比有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。Fig. 7 Filtration rate of Anodonta woodiana exposed to Ca2+ and Cd2+Note: n=5 for each group at each time point; *, # indicate significant difference (P<0.05, P<0.01) compared with the control group at the same time.

2.6 Ca2+和Cd2+處理對背角無齒蚌肝胰臟中AwCaM1表達水平的影響

Ca2+和Cd2+處理可以顯著影響背角無齒蚌肝胰臟中AwCaM1的表達水平(圖8)。與對照組相比，肝胰腺中AwCaM1表達水平上調在0.01、0.02、0.04和0.08 mg·L-1的Ca2+處理組呈時間和劑量依賴模式(圖8(a))。與對照組相比，在0.16 mg·L-1的Ca2+處理組中，AwCaM1表達水平從6 h到72 h增加了56.15%(P<0.05)以上(圖8(a))。與對照組相比，肝胰腺中AwCaM1表達水平上調在1、2和4 mg·L-1的Cd2+處理組呈時間和劑量依賴模式(圖8(b))。與對照組相比，在8 mg·L-1和16 mg·L-1的Cd2+處理組中，AwCaM1 mRNA水平從6 h到72 h增加了65.04%(P<0.01)以上(圖8(b))。

圖8 Ca2+(a)和Cd2+(b)對背角無齒蚌肝胰腺AwCaM1基因表達的影響注：每組每個時間點n=5；*、#表示與同一時間點對照組相比有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。Fig. 8 Temporal expressions of AwCaM1 in hepatopancreas of Anodonta woodiana after Ca2+ (a) and Cd2+ (b) exposureNote: n=5 for each group at each time point; *, # indicate significant difference (P<0.05, P<0.01) compared with the control group at the same time.

2.7 Ca2+和Cd2+處理對背角無齒蚌鰓中AwCaM1表達水平的影響

不同濃度的Ca2+處理能夠顯著誘導背角無齒蚌鰓中AwCaM1表達。6～72 h，鰓中AwCaM1表達水平上調模式在0.01、0.02、0.04和0.08 mg·L-1的Ca2+處理組中呈時間和劑量依賴模式(圖9(a))。與對照組相比，Ca2+處理后背角無齒蚌鰓中AwCaM1表達平均水平增加了79.41%(P<0.01)以上(圖9(a))。與Ca2+處理組AwCaM1的表達模式相同，Cd2+處理后可顯著誘導鰓中AwCaM1表達；與對照組相比，Cd2+處理后背角無齒蚌鰓中AwCaM1表達水平增加了88.23%(P<0.01)以上(圖9(b))。

圖9 Ca2+(a)和Cd2+(b)對背角無齒蚌鰓AwCaM1基因表達的影響注：每組每個時間點n=5；*、#表示與同一時間點對照組相比有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。Fig. 9 Temporal expressions of AwCaM1 in gill of Anodonta woodiana after Ca2+ (a) and Cd2+ (b) exposureNote: n=5 for each group at each time point; *, # indicate significant difference (P<0.05, P<0.01) compared with the control group at the same time.

2.8 Ca2+和Cd2+處理對背角無齒蚌外套膜中AwCaM1表達水平的影響

Ca2+處理后，背角無齒蚌外套膜中AwCaM1上調水平在0.01、0.02、0.04和0.08 mg·L-1處理組呈時間和劑量依賴模式(圖10(a))；與對照組相比，0.16 mg·L-1的Ca2+處理后AwCaM1表達水平在6～72 h增加了1.69倍以上(P<0.01)(圖10(a))。外套膜中AwCaM1表達上調水平在1、2和4 mg·L-1Cd2+處理組呈時間和劑量依賴模式；與對照組相比，8 mg·L-1和16 mg·L-1的Cd2+處理后AwCaM1 mRNA表達水平從6～72 h增加了1.65倍以上(P<0.01) (圖10(b))。

圖10 Ca2+(a)和Cd2+(b)對背角無齒蚌外套膜AwCaM1基因表達的影響注：每組每個時間點n=5；*、#表示與同一時間點對照組相比有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。Fig. 10 Temporal expressions of AwCaM1 in mantle of Anodonta woodiana after Ca2+ (a) and Cd2+ (b) exposureNote: n=5 for each group at each time point; *, # indicate significant difference (P<0.05, P<0.01) compared with the control group at the same time.

3 討論(Discussion)

本研究結果顯示，AwCaM1主要氨基酸序列與已知無脊椎動物和脊椎動物的CaM序列具有高度同源性，提示CaM是生物進化過程中一個保守的基因。與合浦珠母貝CaM氨基酸序列相比，淡水雙殼類三角帆蚌與背角無齒蚌CaM序列在147處存在單個氨基酸差異，即Met分別被Thr和Ser取代，提示這種點突變的取代現象可能與動物進化過程中適應新的環(huán)境條件有關。不同脊椎動物CaM基因編碼具有高度一致氨基酸序列，AwCaM1與甲殼動物大型水蚤和昆蟲黑腹果蠅中的CaM序列具有高度一致性；同時，AwCaM1與人類CaM之間只有3個氨基酸殘基差異。Ca2+是真核生物中重要的第二信使，參與細胞內多種細胞反應，CaM作為Ca2+離子受體，由此，CaM進化過程中保守性與維持細胞增殖、周期調控、微管解聚、激酶和靶蛋白結合等過程密切相關[18]。人類CaM第3個EF-手形結構域磷酸化位點Tyr100在AwCaM1中被Phe100取代，提示磷酸化位取代可能與AwCaM1調控相關[18]。研究顯示，人類Tyr100磷酸化在增加CaM與靶蛋白結合親和力方面發(fā)揮重要作用；EF-手形結構域作為Ca2+配體結合重要位點，氨基酸取代效應必然導致該蛋白質構象的局部改變，進一步影響其與大多數靶蛋白的親和力以及其激活靶蛋白的能力[18]。

Ca2+與CaM結合后參與細胞增殖、周期調控、微管解聚和肌肉收縮等生理功能的調控，不同物種之間CaM空間高度保守，均由4個EF-手形結構域組成并通過一個中央接頭形成2個結構相似的功能域。雖然這些物種CaM序列高度保守，并且具有相似的空間結構，但系統進化結果顯示不同組群之間廣泛存在較低的自限值。盡管淡水貝類和海水貝類同屬于雙殼綱，但在二者之間顯示較遠的親緣進化關系。脊椎動物和無脊椎動物CaM歸入相同的進化類群。由此可見，CaM基因不能有效反映物種之間進化過程中的親緣關系，而是維持動物正常生理功能的重要因子。

所有組織之中外套膜AwCaM1表達水平最高，提示其與動物的殼體形成有關。研究表明，CaM在鰓和外套膜等上皮組織中表達水平較高，肌肉和斧足等非上皮組織中表達水平較低[19]。在軟體動物中，外套膜外側上皮在殼體形成中發(fā)揮關鍵作用[20]。鰓是雙殼類的一個重要的鈣攝取和蓄積器官，鰓中細胞膜Ca2+-ATP酶系統在動物鈣吸收過程中發(fā)揮重要作用[20]。由此，AwCaM1在背角無齒蚌鰓中較高水平表達與鈣的攝取和儲備有密切關系。

本研究從背角無齒蚌分離出2個CaM剪切突變個體，提示背角無齒蚌CaM轉錄過程中存在復雜調控機制并導致喪失功能性突變。功能喪失性突變研究已引起研究人員的廣泛關注，認為喪失功能性突變是一種應對特殊環(huán)境的適應現象，該現象已在人類疾病研究中予以討論和證實[21]。在人類和果蠅基因組研究中發(fā)現，喪失功能性突變的發(fā)生率遠遠超出預期，存在成百上千甚至更多的基因堿基缺失和/或終止密碼子提前突變的現象[18]。真核生物基因表達由多個模塊組成，包括多個不同步驟但彼此相互關聯。在這一聯動過程中，存在能夠檢出基因表達錯誤并確保其準確矯正的強大糾錯機制，反映了基因表達水平對生物細胞和生物體功能實現的重要性。機體和細胞在應對外界溫度、營養(yǎng)成份、礦質元素、重金屬、藥物和病原生物等時脅迫時，基因在轉錄水平和翻譯水平出現組成及結構錯誤，導致基因喪失原有執(zhí)行功能，出現基因在轉錄水平提前終止和蛋白水平錯誤折疊等現象[21]。由此可見，AwCaM2和AwCaM3是CaM基因在轉錄后修飾過程中出現的異常，導致產生了缺少終止密碼子和/或終止信號的剪切突變個體。值得注意的是，AwCaM2和AwCaM3在翻譯水平能否形成功能性蛋白質，有待深入探討和研究。由此，推測背角無齒蚌CaM轉錄過程中存在由復雜調控機制導致的基因突變。

與對照組相比，Cd2+處理后動物的濾過率顯著降低，提示Cd2+處理對動物健康常態(tài)具有明顯的負面效應。雙殼類動物通過虹吸行為過濾水體營養(yǎng)物質，維持生命活動的需要，同時具有凈化水體的作用，動物的虹吸效應和遷移行為常用作衡量水中營養(yǎng)物供給情況以及污染水平，同時也是反映動物健康狀況和應激能力的信號[22]。研究表明，貝類虹吸行為會受到重金屬或農藥的顯著干擾，用3.13 mg·L-1毒死蜱處理后，貝類外殼始終出于閉合狀態(tài)，減少換水效應[22]。雙殼類動物虹吸效應減弱，直接導致氧氣交換減少和攝食量減少，影響能量生成和加速細胞氧化應激，對動物成長、繁殖和生存帶來威脅[22]。

不同濃度的Ca2+處理能夠顯著誘導背角無齒蚌肝胰臟、鰓和外套膜中AwCaM1表達，表明AwCaM1表達誘導作用與維持細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)和提高對環(huán)境適應能力有關。在Ca2+水平增高的情況下，機體通過激活Ca2+-ATP酶表達，上調CaM表達，增加CaM對Ca2+結合能力和細胞對Ca2+吸收能力；Ca2+作為真核生物細胞內重要的第二信使，參與細胞內多種細胞反應，由此，CaM在細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用[14,18]。研究表明，環(huán)境應激源、滲透壓改變和病原微生物入侵等都可以誘導動物CaM的表達。多巴胺、五羥色胺、去甲腎上腺素處理后能夠顯著誘導南美白對蝦血淋巴CaM中表達[23]。哈氏弧菌處理后能夠顯著誘導斑節(jié)對蝦血淋巴CaM表達[24]。脂多糖處理處理能夠顯著誘導克氏原螯蝦腸道、鰓和血淋巴中CaM表達[25]。研究發(fā)現，CaM表達水平高低與南極犬牙魚冷適應能力密切相關，并作為硬骨魚環(huán)境適應過程中重要的分子生物學標志物[26]。以上研究結果表明，CaM不僅在維持細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，而且參與動物環(huán)境適應過程。在0.16 mg·L-1的Ca2+處理過程中，胰臟、鰓和外套膜中AwCaM1表達水平在72 h較48 h有下調現象，進一步提示AwCaM1參與了環(huán)境適應過程。在低濃度條件下，有助于動物對Ca2+結合和吸收，動物保持旺盛的生命活力；在0.01～0.08 mg·L-1的Ca2+處理過程中，背角無齒蚌肝胰臟、鰓和外套膜中AwCaM1表達水平呈時間和劑量依賴性升高。在高濃度條件下，能夠導致環(huán)境應激效應，干擾動物正常生理功能和日常活動，由此在0.16 mg·L-1的Ca2+處理過程中AwCaM1表達水平下調。

不同濃度Cd2+處理可以顯著誘導肝胰腺、鰓和外套膜中AwCaM1表達，提示AwCaM1高表達與Cd2+誘發(fā)的毒性效應有關。水生生物長期暴露于高劑量重金屬環(huán)境中，會發(fā)生顯著的組織和器官損傷。淡水和海水雙殼類動物中發(fā)現Cd2+能夠引起氧化應激效應和DNA的損傷。在紫貽扇貝中，低濃度Cd2+不僅提升H2O2的遺傳毒性，而且助推了8-羥基鳥嘌呤誘發(fā)的DNA修復[27]。進一步研究表明，Cd2+可引起DNA鏈斷裂幾率增加，減少8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶敏感位點[27]。研究表明，Cd2+處理可以破壞Ca2+穩(wěn)態(tài)，導致各種細胞凋亡[25]。Cd2+暴露后，一些Ca2+相關蛋白顯著上調，如神經元鈣傳遞蛋白、肌漿網鈣結合蛋白和鈣調蛋白等[28]?；贑d2+和Ca2+在化學特性上的相似性，一些Ca2+結合蛋白中，Cd2+能夠競爭性結合Ca2+結合蛋白，干擾Ca2+介導的信號轉導通路。研究表明，Cd2+暴露可以導致成骨細胞胞內Cd2+濃度升高，成骨細胞可以通過膜結合轉運體攝取Cd2+[29]。CaM可以結合胞內Cd2+，升高胞內Cd2+，激活Ca2+/鈣調蛋白依賴性激酶通路，誘發(fā)培養(yǎng)系膜細胞和神經細胞死亡[29]。Cd2+存在會對細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)、遺傳信息穩(wěn)定、能量生成和細胞程序化凋亡等帶來巨大威脅，Cd2+處理后AwCaM1高表達與其細胞毒性效應密切相關。

CaM結合和激活動態(tài)事件是一個復雜的過程，深入開展Ca2+相關網絡蛋白功能研究，將有助于明確鈣穩(wěn)態(tài)和細胞對環(huán)境重金屬污染的毒性效應。