結(jié)核分枝桿菌相關(guān)γ-干擾素檢測聯(lián)合結(jié)核桿菌DNA、結(jié)核抗體檢測對菌陰肺結(jié)核陽性檢出率的影響

胡月紅

[摘要]目的研究結(jié)核分枝桿菌相關(guān)γ-干擾素（TB-IGRA）檢測聯(lián)合結(jié)核桿菌脫氧核糖核酸（TB- DNA）、結(jié)核抗體（TB-Ab）檢測菌陰肺結(jié)核患者對陽性檢出率的影響。方法選取2019年3月至2020年3月廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院菌陰肺結(jié)核疑似患者158例，均行 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 檢測，以組織培養(yǎng)及病理檢查為“金標(biāo)準(zhǔn)”，統(tǒng)計 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 單一檢測、兩兩結(jié)合、三者聯(lián)合檢測菌陰肺結(jié)核陽性的診斷結(jié)果，并比較診斷效能（靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度）。結(jié)果 TB-IGRA 檢測肺結(jié)核真陽性81例，真陰性31例;TB-DNA 檢測真陽性60例，真陰性36例;TB-Ab 檢測真陽性73例，真陰性30例;TB-IGRA + TB-DNA 檢測真陽性91例，真陰性27例;TB-IGRA + TB-Ab 檢測真陽性87例，真陰性29例;TB-DNA + TB-Ab 檢測真陽性95例，真陰性28例;TB-IGRA、TB-DNA 及 TB-Ab 三者聯(lián)合檢測肺結(jié)核真陽性108例，真陰性25例;TB-IGRA 檢測肺結(jié)核靈敏度略高于 TB-DNA、TB-Ab 檢測（ P <0.05）;三者聯(lián)合診斷的靈敏度、準(zhǔn)確度高于兩兩聯(lián)合診斷，而兩兩聯(lián)合診斷的靈敏度、準(zhǔn)確度高于 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 單一檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05）。結(jié)論 TB-IGRA、TB-DNA、 TB-Ab 三種方法聯(lián)合檢測能提高菌陰肺結(jié)核患者診斷效能，有助于臨床合理治療方案的制訂，具有良好應(yīng)用價值。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核分枝桿菌相關(guān)γ-干擾素檢測;結(jié)核桿菌 DNA 檢測;結(jié)核抗體檢測;菌陰肺結(jié)核;陽性檢出率

[中圖分類號] R521; R446.6? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2021）23-0146-05

Influence of Mycobacterium tuberculosis-related interferon-γ detection combined with Mycobacterium tuberculosis DNA and tuberculosis antibody detection on positive detection rate of bacterial negative pulmonary tuberculosis

HU? Yuehong

The First Affiliated Hospital of Xiamen University， Fujian， Xiamen 361003， China

[Abstract] Objective To study the influence of Mycobacterium tuberculosis-related interferon-γ（TB-IGRA） detection combined with Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid （TB-DNA） and Tuberculosis antibody （TB-Ab） detection on the positive detection rate of patients with bacterial negative pulmonary tuberculosis （PTB）. Methods A total of 158 suspected patients with bacterial negative PTB in the First Affiliated Hospital of Xiamen University from March 2019 to March 2020 were selected and they were detected for TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab. Taking tissue culture and pathological examination as the "gold standard"， the diagnostic results of single detection， pairwise detection and combined detection of TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab were counted， and the diagnostic efficiency （sensitivity， specificity and accuracy） were compared. Results TB-IGRA detection showed that 81 cases were true positive and 31 cases were true negative. TB-DNA detection informed us of true positive in 60 cases and true negative in 36 cases. TB-Ab detection demonstrated that 73 cases was true positive and 30 cases was true negative. TB-IGRA + TB-DNA detection showed positive in 91 cases and negative in 27 cases. TB-IGRA + TB-Ab detection showed true positive in 87 cases and true negative in 29 cases. TB-DNA + TB-Ab showed true positive in 95 cases and true negative in 28 cases. TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab were combined to detect 108 cases of true positive and 25 cases of true negative PTB. TB-IGRA was slightly more sensitive than TB-DNA and TB-Ab （P <0.05）. The sensitivity and accuracy of the combined diagnosis of the three methods were higher than those of the combined diagnosis of pairwise detection， while the sensitivity and accuracy of the combined diagnosis of pairwise detectionwere higher than those of TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab alone， with statistically significant differences （P <0.05）. Conclusion The combined detection of TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab can improve the diagnostic efficiency of patients with bacterial negative PTB， and contribute to the formulation of rational clinical treatment plan， which has good application value.

[Key words] Detection of Mycobacterium tuberculosis related interferon-γ; Tuberculosis DNA detection; Tuberculosis antibody detection; bacterial negative pulmonary tuberculosis; Positive detection rate

肺結(jié)核是臨床常見慢性傳染疾病，在全球范圍內(nèi)特別是發(fā)展中國家具有較高發(fā)病率，我國結(jié)核病新發(fā)患者近88.9萬，發(fā)病率為63/10萬，臨床診治關(guān)鍵是早期準(zhǔn)確診斷與隔離治療[1]。而對于三次痰涂片與一次培養(yǎng)均為陰性的菌陰肺結(jié)核臨床診斷難度較大，極易出現(xiàn)誤診漏診情況，因此尋求更準(zhǔn)確方法以快速早期診斷結(jié)核病對其防治效果具有重要意義[2]。實驗室檢測指標(biāo)對肺結(jié)核診斷具有重要意義，其中結(jié)核分枝桿菌相關(guān)γ-干擾素（TB- IGRA）是通過檢測受結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激而活化的效應(yīng) T 細(xì)胞來診斷結(jié)核感染，可用于結(jié)核分枝桿菌活動感染或潛伏感染的輔助診斷[3]。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）測定結(jié)核桿菌脫氧核糖核酸（TB-DNA）能直接判斷結(jié)核桿菌診斷效果[4];而結(jié)核抗體（TB-Ab）是通過檢測血清中 IgG 或 IgM 抗體間接反映結(jié)核桿菌陽性情況。本研究選取廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院菌陰肺結(jié)核疑似患者158例，旨在探討 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 聯(lián)合檢測的價值?，F(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，選取2019年3月至2020年3月我院菌陰肺結(jié)核疑似患者158例，其中男82例，女76例;年齡21～74歲，平均（49.68±12.01）歲;體質(zhì)量指數(shù)（BMI）18.2～25.4 kg/m2，平均（22.43±1.19）kg/m2。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合《肺結(jié)核基層診療指南（2018年）》中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5];均伴有咳嗽咳痰、全身疲乏、體重下降等臨床表現(xiàn);均接受 X 線胸部攝片，存在團(tuán)塊狀陰影;精神或意識清晰可配合正常檢查治療;均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他呼吸系統(tǒng)疾病;凝血功能障礙;合并惡性腫瘤、傳染性疾病;既往接受過抗結(jié)核藥物治療;合并嚴(yán)重心肝腎等重要臟器功能障礙。

1.3方法

1.3.1 TB-IGRA 檢測采用靜脈穿刺術(shù)采集全血標(biāo)本4 ml，顛倒混勻后分裝到“N”“T”“P”三種培養(yǎng)管中，1 ml/管，并于37℃培養(yǎng)（22±2）h，然后以3000 r/min 的速度離心10 min，取血漿進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附法檢測;定量檢測 IFN-γ，將濃縮洗滌液用蒸餾水進(jìn)行20倍稀釋，充分溶解后得到400 pg/ml 的校準(zhǔn)品，然后進(jìn)行稀釋，最終得到的校準(zhǔn)品濃度分別為400、200、100、50、25、12.5 pg/ml;將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每個受試者的3種培養(yǎng)血漿各1孔，校準(zhǔn)品各雙孔，空白對照1孔;分別在相應(yīng)孔中加入20μl 樣品稀釋液（除空白對照孔）;分別在相應(yīng)孔中加入50μl 待測樣品或校準(zhǔn)品（除空白對照孔），震蕩混勻，用封板膜封板后，置37℃下溫育60 min;然后每孔加入50μl 酶標(biāo)試劑（除空白對照孔），輕輕震蕩混勻，封板后置37℃下溫育60 min，揭掉封板膜采用洗板機(jī)洗滌5遍;然后每孔各加入50μl 顯色劑 A、B 液，振蕩混勻，于37℃避光顯色15 min;每孔加50μl 終止液，振蕩混勻，10 min 內(nèi)采用酶標(biāo)儀波長于450 nm 處檢測，并用空白孔調(diào)零點后測定各孔 A 值。陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[6]：N 值≤400、P-N 為任何值、T-N ≥14并且≥ N/4時為陽性，提示患者感染結(jié)核分枝桿菌。

1.3.2 TB-DNA 檢測采用廈門致善生物科技股份有限公司提供的儀器，并嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行，將痰處理液或4%氫氧化鈉以痰液體積的1～2倍加入痰液中，觀察痰液黏稠程度，并混合震蕩，30 min 消化至水樣;取1 ml 樣本于1.5 ml 離心管中，并在管蓋上進(jìn)行標(biāo)記;以13000 r/min 的速度離心5 min 后，棄去上清液，再取1 ml 樣本置于1.5 ml 離心管中，重復(fù)0～2次后富集步驟可觀察到沉淀物，取500μl TB-DNA 提取液至1.5 ml 離心管，然后將沉淀物混勻重懸;離心管置于金屬干熱儀上，設(shè)置99℃滅活10 min;準(zhǔn)備試劑條，在左邊第1孔中加入20μl 增強(qiáng)液及預(yù)處理樣本，并在第10孔右沿空白處標(biāo)記編號，儀器運(yùn)行結(jié)束后，取左邊起第10孔為純化 DNA 溶液，置入離心管中，標(biāo)記編號備用;然后以13000 r/min 的速度離心5 min，若觀察到沉淀物則取上清，轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml 離心管中再保存。

1.3.3 TB-Ab 檢測①采用膠體金法測定結(jié)核分枝桿菌的 IgG 抗體，首先在反應(yīng)孔內(nèi)加入1滴緩沖液，完全滲入后加入150μl 待測血清，然后加入金標(biāo)液3滴，最后加洗滌液3滴，于3 min 內(nèi)觀測結(jié)果。若 T 區(qū)出現(xiàn)紅色印跡則為 IgG 抗體陽性，T 區(qū)未出現(xiàn)紅色印跡為 IgG 抗體陰性。②采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法測定結(jié)核分枝桿菌的 IgM 抗體，分別加入稀釋液100μl、標(biāo)本5μl，于37℃下溫浴10 min，洗板5次后加入酶結(jié)合物50μl，經(jīng)溫浴、洗板后加入顯色劑，采用酶標(biāo)儀比色，若 OD 值≥0.2則為 IgM 抗體陽性，OD 值<0.2則為 IgM 抗體陰性。陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[7]：結(jié)核分枝桿菌 IgG 與 IgM 抗體其中一項為陽性則為 TB-Ab 陽性，否則為陰性。

1.3.4組織培養(yǎng)及病理檢查所有患者給予局部麻醉，在胸部 CT 引導(dǎo)下進(jìn)行經(jīng)皮穿刺，采集肺部病灶組織活檢;采用福爾馬林固定活檢樣本，將 NALA 溶解組織與病理組織樣本加入7H9肉湯中，充分碾碎后倒入試管內(nèi)，加入2% NALC-NaOH 溶液，強(qiáng)力震蕩20 s后，加入50 ml磷酸緩沖液（PBS），以3000 r/min 的速度離心15 min 后，棄去上層液后加入2 ml PBS，接種至培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行組織培養(yǎng)，培養(yǎng)6周后能分離出結(jié)核桿菌者即為陽性，否則為陰性。另外，采用包埋法處理石蠟切片，經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察抗酸桿菌，其中經(jīng)染色后，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核為藍(lán)色，抗酸桿菌為紅色，若觀察到抗酸桿菌即為陽性。

1.3.5聯(lián)合診斷標(biāo)準(zhǔn) TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 兩兩結(jié)合檢測與三者聯(lián)合檢測均以任一陽性均為陽性為標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.4觀察指標(biāo)

①比較 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 單一檢測菌陰肺結(jié)核陽性的診斷結(jié)果;②比較 TB-IGRA、TB- DNA、TB-Ab 兩兩結(jié)合檢測的診斷結(jié)果;③比較 TB- IGRA、TB-DNA、TB-Ab 三者聯(lián)合檢測的診斷結(jié)果;④比較 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 單一檢測及聯(lián)合檢測的診斷效能：靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計數(shù)資料以[n （%）]表示，行χ2檢驗，P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab單一檢測結(jié)果

經(jīng)組織培養(yǎng)及病理檢查，158例菌陰肺結(jié)核疑似患者中陽性117例，陰性41例;TB-IGRA 檢測肺結(jié)核真陽性81例，真陰性31例;TB-DNA 檢測真陽性60例，真陰性36例;TB-Ab 檢測真陽性73例，真陰性30例。見表1。

2.2 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab兩兩結(jié)合檢測結(jié)果

TB-IGRA + TB-DNA檢測肺結(jié)核真陽性91例，真陰性27例;TB-IGRA + TB-Ab檢測真陽性87例，真陰性29例;TB-DNA + TB-Ab 檢測真陽性95例，真陰性28例。見表2。

2.3 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab三者聯(lián)合檢測結(jié)果

TB-IGRA、TB-DNA 及 TB-Ab 三者聯(lián)合檢測肺結(jié)核真陽性108例，真陰性25例。見表3。

2.4單一檢測及聯(lián)合檢測診斷效能

TB-IGRA 檢測肺結(jié)核靈敏度略高于 TB-DNA、 TB-Ab 檢測（ P <0.05）;三者聯(lián)合診斷的靈敏度、準(zhǔn)確度高于兩兩聯(lián)合診斷，而兩兩聯(lián)合診斷的靈敏度、準(zhǔn)確度高于 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 單一檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05）。見表4。

3討論

肺結(jié)核是指由結(jié)核分枝桿菌引起、發(fā)生于肺組織、支氣管、胸膜的結(jié)核疾病，傳染性較強(qiáng)、傳播范圍極廣，會嚴(yán)重威脅人類健康[9]?？刂平Y(jié)核病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，提高治愈率，減少肺結(jié)核的流行。

細(xì)菌學(xué)檢查是目前臨床最常用肺結(jié)核檢測方法，同時也是確診及治療方案制訂的重要依據(jù)[10];但由于肺結(jié)核患者痰液呈現(xiàn)間歇性排菌、結(jié)核菌自身生長速度較慢或痰標(biāo)本質(zhì)量不合格等多種因素影響，使痰分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果呈現(xiàn)陰性，導(dǎo)致部分肺結(jié)核患者無法確診，增加傳播風(fēng)險[11]。因此，臨床實踐過程中，應(yīng)配合有效實驗室檢查完善菌陰肺結(jié)核的診斷過程，對病情控制具有重要意義。隨著檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步改善，TB-IGRA、TB-DNA、 TB-Ab 等多種更為快捷簡單的檢測在臨床逐漸開展，且本研究中 TB-IGRA 檢測肺結(jié)核靈敏度略高于 TB-DNA、TB-Ab 檢測（ P <0.05），與龔清河[12]結(jié)果具有一致性。其中 TB-Ab 屬于體液免疫檢查技術(shù)，肺結(jié)核患者會產(chǎn)生結(jié)核桿菌免疫球蛋白， TB-Ab 通過免疫應(yīng)答機(jī)制對機(jī)體抗結(jié)核免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測，據(jù)此診斷是否伴有結(jié)核桿菌的感染[13]。 TB-DNA 檢測作為結(jié)核病診斷的新標(biāo)準(zhǔn)，具有較低誤診率，本研究中診斷肺結(jié)核特異度高達(dá)87.81%，是補(bǔ)充病原學(xué)診斷的最佳選擇，但靈敏度僅有51.28%。而 TB-IGRA 屬于細(xì)胞免疫檢查技術(shù)，肺結(jié)核患者機(jī)體外周 T 淋巴細(xì)胞參與免疫應(yīng)答，受到特異性抗原激活后，會轉(zhuǎn)化為效應(yīng) T 淋巴細(xì)胞，分泌釋放γ-干擾素[14];TB-IGRA 通過微孔條上預(yù)包被的 IFN-γ抗體可與樣品中的 IFN-γ結(jié)合，再加入酶標(biāo)試劑進(jìn)行二次溫育，當(dāng)樣品中存在 IFN-γ時，將形成“包被抗體-IFN-γ-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物，然后形成催化顯色劑反應(yīng)，據(jù)此診斷是否感染結(jié)核菌[15]。由于無論是否有結(jié)核病癥狀、免疫功能水平等均對 TB-IGRA 法結(jié)果影響較小，都能通過檢測效應(yīng) T 細(xì)胞確定是否伴有結(jié)核分枝桿菌的感染，因此 TB-IGRA 法檢測靈敏度略高。多種檢測方法聯(lián)合診斷為臨床提高菌陰肺結(jié)核陽性檢出率提供了新的研究方向[16]?；诖耍狙芯繉?TB-IGRA、 TB-DNA、TB-Ab 三種方法聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果顯示三者聯(lián)合診斷靈敏度、準(zhǔn)確度均高于單一檢測或兩兩聯(lián)合檢測（ P <0.05），其中三者聯(lián)合檢測可將單個方法檢測的靈敏度69.23%、51.28%、62.39%提高至92.31%，因此聯(lián)合檢測能明顯提高診斷效能，減少菌陰肺結(jié)核的漏診誤診，臨床可推廣應(yīng)用。但本研究取樣以單中心為主，且樣本量較小，具有一定局限性，臨床進(jìn)一步研究中應(yīng)擴(kuò)大樣本量，并盡量多中心取樣，保證研究合理性與準(zhǔn)確度;另外，臨床可進(jìn)一步結(jié)合其他診斷方法如結(jié)核菌純蛋白衍生物試驗、TST、HLA-G 等進(jìn)一步提高對肺結(jié)核的診斷價值，為臨床提供更加準(zhǔn)確的診斷結(jié)果，協(xié)助臨床治療。

綜上所述， TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 三種方法聯(lián)合檢測能提高菌陰肺結(jié)核患者診斷效能，有助于臨床合理治療方案的制訂，具有良好應(yīng)用價值。

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（收稿日期：2021-06-22）